胰高血糖素样肽-1对糖尿病大鼠骨硬化蛋白及骨代谢的影响

赵 燕 杜思成 张 燕 宋滇平 李会芳 杨秋萍

(昆明医科大学第一附属医院糖尿病科，云南 昆明 650032)

糖尿病(DM)患者骨质疏松的危害不容忽视。研究发现骨硬化蛋白(SO)可能在2型糖尿病(T2DM)骨质疏松的发病中起重要作用〔1〕。研究认为胰高血糖素样肽(GLP)-1对骨代谢有调节作用〔2〕。本文拟探讨GLP-1类似物(利拉鲁肽)对T2DM大鼠血清SO及骨密度(BMD)、骨形态学的影响。

1 材料与方法

1.1建模及分组 挑选昆明种健康雄性SD大鼠90只(体重200～224 g，购自昆明医科大学实验动物中心)，按照随机数字表法分为正常对照组(NC，20只)及实验组(70只)。给予适应性喂养1 w。NC组喂普通饲料，实验组喂高脂高糖饲料〔1〕。喂养第5周末，禁食12 h。实验组：一次性予链脲佐菌素(STZ)35 mg/kg，左下腹腔注射，诱导形成T2DM大鼠模型。NC组：一次性予相同剂量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，左下腹腔注射。将成模(72 h后测随机血糖≥16．7 mmol/L视为造模成功)大鼠55只按血糖随机分为利拉鲁肽低剂量干预组(400 μg·kg-1·d-1，LR-L组，18只)、利拉鲁肽高剂量干预组(800 μg·kg-1·d-1，LR-H组，18只)、DM组19只，分别经给药干预后观察。

1.2给药方法 干预4 w。利拉鲁肽(购自诺和诺德中国制药有限公司)每日皮下注射一次。NC组、DM组：予利拉鲁肽等量的生理盐水，每日皮下注射一次。干预期间，所有大鼠普通饲料喂养，饮水自由4 w干预后，予3%戊巴比妥钠麻醉并处死大鼠，最终NC组13只，DM组7只，LR-L组8只，LR-H组11只。分别取大鼠心房血经离心后提取上清液3 ml置于抗凝管(-20℃冰箱待测)。取大鼠左侧股骨10%(体积分数)中性甲醛固定，苏木素-伊红(HE)染色观察骨形态学改变。

1.3观察指标和检测方法 采用全自动生化分析仪(型号：OlympasAU2700)，分别检测血钙(Ca)、磷(P)。采用酶联免疫吸附剂法(ELISA)分别检测I型胶原交联C末端肽(CTX-1)、骨保护素(BGP)、SO。采用双能 X 线骨密度仪(BEXA，型号厂家：美国GE公司Prodigy Advance型骨密度仪)分别检测全身、腰椎、股骨、骨盆的BMD。沿大鼠股骨标本矢状面切成5 μm薄片标本，经HE染色。采用光学显微镜，观察骨形态(包括骨小梁面积、骨小梁宽度及骨小梁间距等方面)，经彩色数码照相系统采集图像。

1.4统计学方法 应用SPSS11.5软件进行方差分析、LSD检验。

2 结 果

2.1大鼠骨组织形态学改变 NC组大鼠骨组织骨小梁宽、粗，密集，小梁间距较小，成网状排列均匀；DM组可见骨小梁稀疏、数量少而间隙大，小梁变细且连续性破坏，游离断端增多；LR-L组及LR-H组与DM比较其骨小梁增加明显，骨小梁宽且间距小，游离断端偶见。见图1。

图1 大鼠骨组织HE染色

2.2大鼠血糖、骨代谢生化指标及SO的变化 与NC组比较，DM组空腹血糖(FPG)水平显著升高(P<0.05)，与DM组比较，LR-L组、LH-R组FPG水平显著下降(P<0.05)，但LR-L组与LH-R组比较差异无统计学意义(P>0.05)。 4组血清P、Ca、CTX-1、BGP水平差异均无统计学意义(P>0.05)。与NC组比较，DM组血清SO水平显著升高(P<0.05)；与DM组比较，LR-L、LR-H组有所下降，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3各组大鼠BMD比较 与NC组比较，DM、LR-L、LR-H组大鼠全身及各部位BMD均降低(P<0.05)，DM、LR-L、LR-H组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 各组骨代谢指标及骨硬化蛋白的变化

与NC组比较：1)P<0.05；与DM组比较：2)P<0.05；下表同

表2 各组BMD的变化

3 讨 论

DM并发骨质疏松的机制尚未完全阐明〔3〕。骨代谢标志物有助于早期反映骨代谢状况，或辅助评判治疗骨质疏松的临床效果〔4〕。有研究表明循环SO水平与DM、高血脂、肥胖、高尿酸症代谢因素密切相关〔5～7〕。有研究发现，T2DM组血循环中SO的水平高于非T2DM绝经妇女对照组，两组SO水平都随着年龄的增加而增加；在T2DM组，SO水平与PTH 、碱性磷酸酶呈负相关，而与CTX-1呈正相关。认为高SO可能是T2DM发生骨量减少的发病机制〔8〕。但有研究〔6〕发现T2DM骨质疏松患者的SO水平低于T2DM非骨质疏松人群，认为T2DM患者其Wnt/β-catenin信号通路已经受损。因此，SO对DM骨代谢的影响还需进一步深入研究。本研究提示T2DM大鼠骨形成减少。与Hie等〔9〕的研究结果一致。

资料显示〔10〕，DM增加骨质疏松合并骨折的风险。本研究结果表明T2DM引起了大鼠股骨的骨量减少，与王亮等〔11〕的研究结果基本一致。本研究骨病理学检查结果，均可以证实DM大鼠骨吸收有增加。利拉鲁肽为人工合成GLP-1类似物。有研究发现，GLP-1类似物能降低血糖但很少会诱发低血糖〔12〕。动物实验结果发现〔13〕，GLP-1对骨代谢有正性调节作用。郭玉卿等〔14〕认为，在T2DM大鼠发生骨质疏松、大骨骼肌活性降低的过程中可能存在PI3K/AKT信号通路活性降低的作用。本研究结果提示利拉鲁肽减轻体重的作用抵消了其对BMD的正性调节作用。另外，本研究还存在实验观察时间短等不足。

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2赵 燕，王 艳，张 燕,等.GLP-1对糖尿病大鼠血清OPG、RANKL及骨密度的影响研究〔J〕.中国骨质疏松杂志,2016;22(6)：700-5.

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6Gaudio A,Privitera F,Battaglia K,etal.Sclerostin levels associated with inhibition of the Wnt/beta-catenin signaling and reduced bone turnover in type 2 diabetes mellitus〔J〕.J Clin Endocrinol Metab,2012;97(10):3744-50.

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8Zhou YJ,Li A,Song YL,etal.Role of sclerostin in the bone loss of postmenopausal chinese women with type 2 diabetes〔J〕.Chin Med Sci J,2013;28(3):135-9.

9Hie M,Iitsuka N,Otsuka T,etal.insulin-dependent diabetes mellitus decreaes osteoblastogenesis associated with the inhibition of wnt signaling through increased expression of sost and dkk1 and inhibition of akt activation〔J〕.Int J Mol Med,2011;28(3):455-62.

10Prisby RD,Swift JM,Bloomfield SA,etal.Altered bone mass,geometry and mechanical proper ties during the development and progression of type 2 diabetes in the zucker diabetic fatty rat〔J〕.J Endocrinol,2008;199(3):379-88.

11王 亮,马远征,曾 晓,等.2型糖尿病大鼠模型建立及骨密度特点研究〔J〕.中国骨质疏松杂志,2010;16(5):331-3.

12Beck-Nielsen H.Glucagon-like peptide 1 analogues in the treatment of type 2 diabetes mellitus〔J〕.Ugeskr Laeger,2012;174(23):1606-8.

13Ceccarelli E,Guarino EG,Merlotti D,etal.Beyond glycemic control in diabetes mellitus:effects of incretin-based therapies on bone metabolism〔J〕.Front Endocrinol(Lausanne),2013;4:73.

14郭玉卿,王丽娜,刘 璠,等.PI3 K在2型糖尿病模型大鼠骨质疏松中的作用及LY294002的干预效果〔J〕.中国老年学杂志,2016;36(14):3377-9.