急性痛风性关节炎患者TLRs/MyD88的表达及其与中医证型关系的初探

刘静 谢克琴 曹跃鹏 刘正奇 邓志勇 李贺 孙贵炎 吕宁霁 马武开 钟琴

【摘 要】目的：研究急性痛風性关节炎患者外周血Toll样受体2（TLR2）、Toll样受体4（TLR4）、髓样分化因子88（MyD88）的表达及其与中医证型的关系，为中医学的辨证论治提供客观依据。方法：将66例急性痛风性关节炎患者根据中医辨证分型分为湿热蕴结型48例，痰浊阻滞型6例，瘀热阻滞型10例，肝肾阴虚型2例。同时随机选取健康体检者20例为健康对照组。检测C-反应蛋白（CRP）、红细胞沉降率（ESR）水平，通过ELISA检测外周血中TLR2、TLR4、MyD88的浓度；采用SPSS 22.0软件分析急性痛风性关节炎患者外周血TLR2、TLR4、MyD88与不同中医证型的关系。结果：①急性痛风性关节炎患者外周血TLR2、TLR4、MyD88浓度较健康对照组显著升高（P < 0.01）。②痛风性关节炎患者外周血TLR2与ESR、CRP呈正相关（P < 0.01）。③各中医证型的痛风性关节炎患者男性所占比例明显大于女性；在年龄方面，4个证型的痛风患者差异无统计学意义（P > 0.05）。④湿热蕴结型痛风性关节炎患者外周血ESR、CRP值明显高于其他3型，差异有统计学意义（P < 0.01）。⑤TLR2在各证型之间两两比较，差异有统计学意义（P < 0.01）。TLR4、MyD88在肝肾阴虚型与瘀热阻滞型之间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；其他各证型之间两两比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。结论：TLR2、TLR4、MyD88可以反映痛风性关节炎的炎症轻重。湿热蕴结型痛风患者炎症反应更为活跃，与急性痛风性关节炎密切相关。

【关键词】 痛风性关节炎；中医证型；Toll样受体；髓样分化因子88；辨证论治

【ABSTRACT】Objective：To study the expressions of TLR2，TLR4 and MyD88 in peripheral blood of patients with acute gouty arthritis and their relationship with TCM syndrome patterns，so as to provide objective basis for TCM syndrome differentiation and treatment.Methods：Sixty cases of acute gouty arthritis，according to TCM syndrome，were divided into the damp-heat-accumulation syndrome pattern（48 cases），the phlegm-turbidity-blockage syndrome pattern（6 cases），the stasis-heat-accumulation syndrome pattern（10 cases），and the liver-kidney-yin-deficiency syndromepattern（2 cases）.At the same time，20 healthysubjects were randomly selected as the healthycontrol group.The levels of C-reactive protein（CRP）and erythrocyte sedimentation rate（ESR）were detected.The concentrations of TLR2，TLR4 and MyD88 in peripheral blood were detected by ELISA.The relationships between TLR2，TLR4 and MyD88 in peripheral blood and different TCM syndromes were analyzed by software SPSS 22.0.Results：①The concentration of TLR2，TLR4 and MyD88 in the peripheral blood of patients with acute gouty arthritis was significantly higher than that in the healthy control group（P < 0.01）.②There was a positive correlation between TLR2 and ESR and CRP in patients with gouty arthritis（P < 0.01）；③The proportion of men with gouty arthritis in all TCM syndrome patterns was significantly larger than that in women.In terms of age，there was no statistically significant difference in four syndrome patterns（P > 0.05）.④ESR and CRP values in peripheral blood of the damp-heat-accumulation syndrome pattern was significantly higher than that in the other three syndrome patterns，and the difference was statistically significant（P < 0.01）.⑤The difference was statistically significant（P < 0.01）between each two syndrome patterns.There was no significant difference of TLR4 and MyD88 between the liver-kidney-yin-deficiency syndrome pattern and the stasis-heat-accumulation syndrome pattern（P > 0.05）.There was a significant difference between each two syndrome patterns（P < 0.05）.Conclusion：TLR2，TLR4 and MyD88 can reflect the severity of gouty arthritis.Inflammation in the stasis-heat-accumulation syndrome pattern is more active and closely related to acute gouty arthritis.

【Keywords】 gouty arthritis；TCM syndrome pattern；TLRs；MyD88；syndrome differentiation and treatment

单钠尿酸盐（MSU）结晶在关节软骨、滑膜及周围组织等沉积而引发非特异性炎症反应，是急性痛风性关节炎的典型特点。MSU是一种内源性危险信号相关分子（DAMPs），被机体识别后通过固有免疫引起炎症和细胞凋亡[1]。有关急性痛风性关节炎的机制研究显示：Toll样受体（TLRs）介导的通路和髓样分化因子88（MyD88）依赖的白细胞介素（IL）-1受体途径与尿酸钠结晶引起的急性炎症有关，单核巨噬细胞的细胞膜表面存在Toll样受体2（TLR2）和Toll样受体4（TLR4），可以识别细胞外的MSU晶体，并诱导IL-1β前体的转录，从而产生一系列炎症级联反应[2]。TLRs通过识别相应的配体，并与之结合，再通过MyD88和干扰素TIR结构域衔接蛋白（TRIF）依赖性途径（非MyD88依赖性途径）下传信号，激活核转录因子-κB（NF-κB）和激活蛋白1（AP-1），启动相关靶基因的转录，快速激活致炎因子IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素（IFN）、趋化性细胞因子、黏附分子、环氧化酶-2（COX-2）和诱生型一氧化氮合成酶的转录，这些酶的产物和细胞因子在炎症反应中发挥关键作用[3-10]。因此，TLR/MyD88信号通路是一个具有多种调节功能的传导通路，在痛风性关节炎的炎症反应过程中起重要作用[11]。

该研究以急性痛风性关节炎的发病机制及中医辨证论治理论为指导，分析急性痛风性关节炎的中医证型与发病机制之间的内在联系，构建中医理论与现代科学技术、宏观辨证与微观指标、辨病与辨证相结合的学术思想，从而在新的研究技术和方法引入的条件下可能有效地前瞻研究中医证型相关基因与中医辨证等复杂的科学问题。检测痛风性关节炎外周血TLRs/MyD88信号实验室指标，探讨其与中医证型间的关系，对认识痛风中医证型与关节炎的发生机制具有重要的临床意义，可以为中医辨证提供客观依据，对中医证型的客观化提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2015年12月至2016年10月在贵阳中医学院第二附属医院风湿免疫科就诊的门诊和住院急性痛风性关节炎患者66例，男63例，女3例；年龄21～69岁，平均（48.76±9.20）岁。所有患者均符合2015年美国风湿病学会（ACR）/欧洲抗风湿病联盟（EULAR）提出的痛风分类标准[12]。健康对照组随机抽取贵阳中医学院第二附属医院体检中心健康者20例，男19例，女1例；年龄24～69岁，平均（46.70±13.44）岁。2组在性别、年龄等方面比较，差异无统计学意义

（P > 0.05），具有可比性。操作流程符合贵阳中医学院第二附属医院人体试验委员会伦理审核标准。参与者均签署知情同意书；排除严重心脑血管疾病及合并其他风湿免疫性疾病者。

1.2 试验仪器及试剂 三重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；-20 ℃冰箱、4 ℃冰箱（中科美菱）；低温高速离心机（美国Thermo Forma公司）；超净工作台（苏洁净化有限公司）；酶标仪（美国BioTek公司）；电热恒温水域箱（天津泰斯特仪器有限公司）；微量移液枪（德国eppendorf公司）；洗板机（凯特生物医疗电子科技有限公司-KWP-100A）；血沉仪（越华XC-A3A）；全自动生化分析仪（日本TOSHIBA公司）；TLR4 ELISA试剂盒（上海劲马生物科技有限公司，JM1062582）；TLR2 ELISA试剂盒（上海劲马生物科技有限公司，JM1062653）；MyD88 ELISA试剂盒（上海劲马生物科技有限公司，JM1062577）。

1.3 观察指标 ①一般临床信息：年龄、性别等。②采集患者的临床症状、体征、舌脉等，进行中医辨证分型，参照痛风的诊断依据、证候分类、疗效评定—中华人民共和国中医药行业标准《中医内科病证诊断疗效标准》（ZY/T001.1-94）[13]分为4个证型。其中湿热蕴结型48例，痰浊阻滞型6例，瘀热阻滞型10例，肝肾阴虚型2例。

③炎症指标：所有病例均清晨空腹肘部静脉采血，分别用常规抗凝管、生化管采集5 mL静脉血，随即送往贵阳中医学院第二附属医院检验科检测

C-反应蛋白（CRP）和红细胞沉降率（ESR）。④空腹采集患者静脉血进行离心分离血清，放于-20 ℃冰箱保存，供ELISA检测患者外周静脉血TLR2、TLR4、MyD88的浓度，按照试剂盒说明书进行操作。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以表示，符合正态分布，满足方差齐性，2组间比较采用独立样本t检验，多组间样本资料采用单因素方差分析；不符合正態分布采用非参数（秩和）检验；计数资料采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各中医证型性别、年龄分布情况 各证型痛风患者男性所占比例明显大于女性。4个证型的痛风患者在年龄上比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.2 各中医证型ESR、CRP的关系 湿热蕴结型痛风患者外周血ESR、CRP值明显高于痰浊阻滞型、瘀热阻滞型、肝肾阴虚型，差异有统计学意义（P < 0.01）。见表2。

2.3 TLR2、TLR4、MyD88与炎症指标的相关性分析 各指标经检验后呈偏态分布，采用Spearman检验分析其相关性，结果提示，痛风患者外周血TLR2与ESR、CRP呈线性正相关（P < 0.01）。见表3。

2.4 痛风组与健康对照组TLR2、TLR4、MyD88的比较 痛风组患者外周血TLR2、TLR4、MyD88的质量分数明显高于健康对照组，差异有统计学意义（P < 0.01）。见表4。

2.5 各中医证型TLR2、TLR4、MyD88的比较 TLR2在各证型之间两两比较，差异有统计学意义（P < 0.01）。TLR4、MyD88在肝肾阴虚型与瘀热阻滞型之间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。其他各证型之间两两比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表5。

3 讨 论

3.1 急性痛风性关节炎与TLR2、TLR4、MyD88 TLRs是Ⅰ型跨膜蛋白受体，包括胞外区、跨膜区、胞内区，胞外区含有不同长度的亮氨酸重复区域，参与配体的识别；细胞内羧基末端包含一个保守部位，与IL-1受体相似，被称为Toll/IL-1受体结构域（TIR），依赖TIR的嗜同性作用和下游接头蛋白的TIR结合来传导信号[14]。MyD88是Toll/IL-1R家族和死亡结构域的家族成员，有TIR的结构域，为TLRs信号通路中关键性的一个接头分子，TLRs识别相应配体，通过MyD88依赖途径及其非依赖途径进行信号转导。MyD88依赖性信号传导途径为TLR信号传导的共有通路，可以和TIR家族胞内的TIR结构域相互作用，在传递上游信息和疾病发生发展中起承上启下传导激活信号的作用，导致下游多种转录因子的激活，促进炎性基因和其他机体防御蛋白的转录，最终启动先天性免疫应答[15]。TLRs通过识别相应的配体，激活机体并产生免疫应答，在固有免疫、炎症因子产生及信号传递中发挥着重要作用[16]。高尿酸血症是发生痛风的生化基础，但只有5%～12%的高尿酸血症患者会最终发展成痛风。高尿酸血症发展成痛风的机制研究：IL-β是MSU晶体诱导炎症的关键因子，而TLR2和TLR4可以识别细胞外的MSU晶体，诱导IL-β前体的转录[17]。TLRs是决定MSU晶体沉积引起急性痛风性关节炎的主要因素，TLRs/MyD88信号通路参与急性痛风性关节炎的炎症反应过程。近年来，多项研究也均表明，TLR2、TLR4、MyD88在痛风发病中起着重要作用。蒋莉等[3]研究发现，TLR4 mRNA、急性痛风性关节炎组NF-κB明显高于痛风性关节炎非急性组和正常对照组。刘丽琼等[18]实验研究发现，TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB基因的表达水平急性炎症小鼠模型中显著增加。FU?BROICH等[19]应用脂多糖（LPS）刺激单核细胞MUTZ-3细胞建立炎症模型，结果发现，炎性细胞的TLR2和TLR4的表达明显增加。在一项关于痛风康Ⅱ号颗粒对急性痛风性关节炎TLRs/MyD88通路影响的研究中发现，在急性痛风性关节炎模型大鼠关节滑膜组织中TLR2、TLR4、MyD88的表达较正常关节滑膜组织明显增多（P < 0.01）[20]。以上国内外诸多研究均说明TLR2、TLR4、MyD88在急性痛风性关节炎的发生、发展中起着不可忽视的作用。

3.2 中医证型与痛风性关节炎 李远上等[21]临床观察认为中医辨证分型治疗痛风性关节炎可以有效改善患者症状、实验室指标，提高临床疗效。刘佳等[22]对百余篇论文进行总结归纳，痛风性关节炎的中医临床辨证分型主要有湿热、痰浊、血瘀、寒湿、肝肾亏虚、脾虚6型。黄女娜[23]通过回顾性研究分析203例痛风性关节炎患者的中医证候特点，分为脾虚湿瘀证、湿热蕴结证、肝肾阴虚证、瘀热阻滞证，其中急性痛风性关节炎以湿热蕴结证为主。中医辨证不外寒热虚实两端，痛风性关节炎的病因多为寒、热、虚、实（湿、痰、瘀）等。通过诸多文献整理发现，痛风性关节炎的辨证分型颇多，各家意见不同，没有统一的指导规范。所以应进一步加强对本病的中医辨证论治规律探讨和研究，尤其是分析能否结合相关客观指标进行辨证，使中医证型客观化，对临床有重要指导意义。只有与西医学紧密结合，辨病与辨证结合，互为补充，更为客观地认识疾病、指导治疗，才能从根本上提升中医药治疗痛风性关节炎效果及研究水平，并有益于进一步广泛推广。

3.3 急性痛风性关节炎中医证型与一般资料的关系 本研究发现急性痛风性关节炎的发病以男性居多，且发病年龄越来越年轻化。痛风性关节炎是一种代谢性疾病，国内外众多流行病学调查均显示其发病率呈逐年上升趋势，各年龄段均可发病，发病越来越年轻化。痛风性关节炎发病率男性高于女性，男女之比约为20∶1[24]。女性发病率较低与性激素作用有关，发病年龄可能与家族遗传史、生活习惯等有关[25]。所有纳入病例湿热蕴结型最多，占72.73%，肝肾阴虚型所占比例最小，为3.03%。临床上痛风性关节炎一般分为急性期、间歇期、缓解期，急性痛风性关节炎患者以湿热蕴结型为主，这与既往研究相符合。

3.4 急性痛风性关节炎中医证型与炎症的关系 ESR、CRP目前被普遍认为是炎症过程中的急性时相反应物。本研究4种证型的ESR、CRP平均值均高于正常值，说明不同证型的痛风性关节炎患者均存在不同程度的炎症。4个证型CRP、ESR比较，湿热蕴结型均高于痰浊阻滞型、瘀热阻滞型、肝肾阴虚型。这与既往的研究结果一致[26]。湿热蕴结，阻滞经络，正邪交争激烈，炎癥反应强烈，体现出湿热之邪在痛风性关节炎病情活动中的重要作用，这说明湿浊、热毒既是痛风性关节炎的致病因素，也是其发展的代谢产物，可以为临床中医辨证治疗痛风提供客观依据。

3.5 急性痛风性关节炎中医证型与TLR2、TLR4、MyD88的关系 TLR2、TLR4及其衔接蛋白MyD88参与了MSU晶体的识别，并诱导免疫细胞对MSU的吞噬及细胞炎性因子的产生，参与急性痛风性关节炎的发生、发展[27-29]。本研究发现急性痛风性关节炎患者外周血TLR2、TLR4、MyD88的浓度明显升高，并与炎症指标ESR、CRP呈正相关，这进一步证实TLR2、TLR4、MyD88参与急性痛风性关节炎的发生、发展。急性痛风性关节炎的辨证多为湿热蕴结型[30]，国内外众多研究均表明TLR2、TLR4、MyD88与炎症反应密切相关[17-20]。本研究结果提示，急性痛风性关节炎患者以湿热蕴结型为主，TLR2、TLR4、MyD88与急性痛风性关节炎患者的发病相关，其中湿热蕴结型患者相关性最高，可能是湿热蕴结型患者的炎症反应最重。

综上所述，TLR2、TLR4、MyD88可以反映急性痛风性关节炎的炎症轻重。湿热蕴结型患者炎症反应更为活跃，与急性痛风性关节炎的严重程度密切相关。本研究为痛风性关节炎中医证型的客观化提供了理论依据，临证时，可以在传统四诊合参的基础上加入患者的客观指标，以更好地指导治疗、选择药物。但本研究存在样本量不足、范围局限等问题，有待开展多中心、大样本的分析研究来进一步深入了解客观指标与中医证型的相关性。

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