川芎嗪对胶原性关节炎大鼠滑膜细胞增殖、凋亡及滑膜组织中p53表达的影响

李宜川 刘国玲 芦琨 常景芝 刘青 郭娅丽

【摘 要】目的：观察川芎嗪（TMP）对胶原性关节炎（CIA）大鼠滑膜组织细胞的增殖、凋亡及滑膜组织中p53表达的影响，并进一步探讨其治疗类风湿关节炎的可能机制。方法：将50只SD大鼠随机分为正常对照组10只和模型组40只。模型组采用Ⅱ型胶原诱导大鼠CIA模型，36只大鼠造模成功。将造模成功的36只大鼠随机分为模型对照组、地塞米松组、TMP高剂量组和TMP低剂量组，每组9只。正常对照组和模型对照组给予2 mL·kg-1生理盐水肌肉注射，地塞米松组给予地塞米松2 mg·kg-1肌肉注射，TMP高剂量组肌肉给药TMP 100 mg·kg-1，TMP低剂量组肌肉给药TMP 50 mg·kg-1。观察

CIA大鼠足肿胀度与关节炎指数，MTT法检测TMP对CIA大鼠足关节滑膜细胞增殖的影响，碱性磷酸酶标记法检测CIA大鼠足关节滑膜细胞凋亡，免疫组化法检测CIA大鼠足关节滑膜细胞p53表达。结果：TMP高剂量组大鼠足爪肿胀程度峰值降低，关节炎指数下降（P < 0.01）；TMP（100 mg·kg-1）可抑制CIA大鼠关节滑膜细胞的增殖，增高大鼠滑膜细胞凋亡积分（P < 0.01），明显降低p53表达（P < 0.01）。结论：TMP（100 mg·kg-1）可抑制CIA大鼠的足爪肿胀和多发性关节炎，对CIA大鼠具有明顯的治疗作用；其机制可能是通过降低CIA大鼠滑膜细胞p53的异常表达水平，促进滑膜细胞凋亡，抑制关节滑膜细胞增殖，减轻局部慢性炎症反应，从而对CIA大鼠发挥治疗作用。

【关键词】 关节炎，类风湿；胶原诱导性；川芎嗪；滑膜细胞；增殖；凋亡；p53；大鼠

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of tetramethylpyrazine（TMP）on the proliferation，apoptosis of synovial cells and the expression of p53 in synovial tissue of rats with collagen induced arthritis and further explore its possible mechanism in the treatment of rheumatoid arthritis.Methods：Fifty SD rats were randomly divided into a normal control group（10 rats）and a model group（40 rats）.The model group was induced by type Ⅱ collagen to establish 36 CAI rat models which then were randomly divided into a model control group，a dexamethasone group，a high-dose TMP group and a low-dose TMP group，with 9 rats in each.The normal control group and the model control group were given an intramuscular injection of 2 mL·kg-1 of physiological saline.The dexamethasone group was given an intramuscular injection of 2 mg·kg-1 of dexamethasone.The high-dose TMP group and the low-dose TMP group were medicated to muscles respectively 100 mg·kg-1 and 50 mg·kg-1of TMP.The foot swelling and arthritis index of the CIA rats were observed.MTT method was used to detect the influence of TMP on the proliferation of synovial cells of CIA foot joints.Alkaline phosphatase labeling was used to detect the apoptosis of synovial cells in the foot joints of CIA rats.The immunohistochemistry method was used to detect the expression of p53 in the synovial cells in foot joints of CIA rats.Results：The paw swelling peak and arthritis index decreased in the high-dose TMP group（P < 0.01）；TMP（100 mg·kg-1）could inhibit the proliferation of synovial cells in CIA rats，increase apoptosis integral of synovial cells（P < 0.01），and significantly reduce the expression of p53（P < 0.01）.Conclusion：TMP（100 mg·kg-1）can inhibit the paw swelling of CIA rats and polyarthritis and has an obvious therapeutic effect on CIA rats，whose treating mechanism may be through reducing the abnormal expression of p53 in synovial cells of CIA rats，promoting apoptosis of synovial cells，inhibiting synovial cell proliferation and reducing the local chronic inflammation reaction.

【Keywords】 arthritis，rheumatoid；collagen inducibility；tetramethylpyrazine；synovial cells；proliferation；apoptosis；p53；rats

类风湿关节炎（rheumation arthritis，RA）是以晨僵、关节肿痛、活动受限为主要临床表现，以关节滑膜为靶器官的自身免疫性疾病，以慢性滑膜炎、滑膜细胞增生、骨质与软骨破坏为主要病理特征，最终导致受累关节发生畸形而出现关节废用、致残，严重影响患者的生活质量。RA的发病与细胞因子、遗传、感染等多种因素有关[1]，由于其发病机制还不完全明确，对其防治就显得十分艰难。早期的非甾体抗炎药、糖皮质激素以及各种新型抗RA药物都存在着诸多不良反应，使患者难以接受。川芎嗪（TMP）是从川芎的生物碱中分离得到的有效单体，具有活血行气、抑制血小板聚集、抑制血管内皮细胞增殖、抑制RA炎症因子分泌、防止自身抗体的大量产生和抗肿瘤等作用[2-3]。张利省等[4-5]将TMP用于治疗RA，效果显著。但其作用机制尚未明确报道。有研究报道，RA关节滑膜组织增生的原因与滑膜细胞凋亡机制障碍引起滑膜细胞增殖和凋亡之間的失衡有关[6]。本实验在成功建立大鼠胶原性关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型的基础上，通过观察CIA大鼠关节炎的变化，检测CIA大鼠足关节滑膜细胞增殖、凋亡和滑膜组织中p53的表达，探讨TMP治疗RA可能的作用途径，为TMP的进一步开发、利用及更有效的临床治疗提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康SD大鼠50只，清洁Ⅱ级，鼠龄3个月，雌雄各半，体质量160～180 g，由山西医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（晋）20150001。大鼠分笼饲养，专人管理，自由摄食和饮水，饲养环境温度22～24℃，相对湿度为40%～60%。

1.2 试 剂 磷酸川芎嗪片（无锡市第七制药厂）；弗氏完全佐剂、鸡Ⅱ型胶原（上海本草生物医学工程所）；胎牛血清（FBS）、胰酶（EDTA）、DMEM培养基、PBS（Sigma公司）；MTT、二甲基亚砜（DMSO）（Gibco公司）。

1.3 仪 器 WD-9409型超净工作台（北京六一仪器厂）；80-2型离心机（上海手术器械厂）；CO2培养箱（德国Heraeus公司提供）；EL30型酶标仪（美国Bio-Tek公司）；倒置显微镜（Olympus公司）。

2 方 法

2.1 CIA大鼠模型的制备及用药 实验用大鼠50只，随机分为正常对照组10只和模型组40只。模型组采用Ⅱ型胶原诱导CIA大鼠模型，方法为将鸡CⅡ和等体积弗氏完全佐剂混合充分乳化后，制成胶原质量分数为1 mg·mL-1的CⅡ乳剂，将混悬乳剂1 mL在大鼠的左后肢足跖皮内皮下给予致炎，7 d后在大鼠尾、背6～8个部位皮下给予0.1 mL该胶原乳剂作为加强免疫，共36只大鼠造模成功。正常对照组等容量相同部位注射0.1 mL生理盐水。将36只造模成功的大鼠随机分为模型对照组、地塞米松组、TMP高剂量组和TMP低剂量组，每组 9只。于造模后第7天至第35天每日给药1次，地塞米松组给予地塞米松注射液2 mg·kg-1肌肉注射，TMP高剂量组肌肉给药TMP 100 mg·kg-1，TMP低剂量组肌肉给药TMP 50 mg·kg-1[7]，正常对照组和模型对照组给予2 mL·kg-1生理盐水肌肉注射。

2.2 CIA大鼠足肿胀度测量 用足容积测定仪分别于给药前及给药后第7，14，18，22，26，30天测左足体积，计算足肿胀度，公式 =（给药后值-给药前值）/给药前值×100%。

2.3 关节炎指数的变化 从致炎后第7天起开始观察记录，第14天起各组每隔4天进行关节炎指数评分[8]。

2.4 TMP对细胞增殖的影响 造膜35 d后处死大鼠，无菌情况下取下滑膜组织，质量分数为0.2%的Ⅱ型胶原酶消化液加入含体积分数为10%胎牛血清DMEM培养液中，置于37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养消化，传代培养[9]。MTT法检测TMP对细胞增殖的影响：将对数生长期的滑膜细胞以1×105·mL-1的密度接种于96孔细胞培养板，孵育24 h，待细胞贴壁后，分别在各个培养孔中加入不同浓度的TMP 10 μL，以及含体积分数为10% FBS的DMEM培养液90 μL，使各孔的溶液体积为200 μL。继续孵育48 h后，加入四甲基偶氮唑蓝（MTT）溶液（5 mg·mL-1）20 μL，37 ℃继续孵育4 h，弃去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，摇床低速振荡10 min，用酶标检测仪于490 nm波长处测吸光度OD值（A值）。实验重复3次，记录结果。

2.5 滑膜细胞凋亡检测 按照试剂盒操作步骤进行碱性磷酸酶标记法检测细胞凋亡，检测结果判断：在滑膜组织中，细胞皱缩，凋亡细胞核呈深蓝色或青紫色，凋亡细胞周围无炎症反应表现，每张切片选取5～10个视野，沿滑膜组织带计算400倍视野中细胞的凋亡数，标出每个视野平均细胞凋亡数[10]。

2.6 p53表达检测 按照试剂盒操作步骤进行免疫组化法p53蛋白表达检测，检测结果判断：p53蛋白表达阳性的滑膜组织细胞核呈橘黄色或棕褐色，每张切片沿滑膜组织带计算400倍视野中阳性细胞的占有率，计数3个视野，标出每个视野平均阳性细胞占有率，并按阳性细胞占有率分为5级。0，无阳性细胞；+，阳性细胞率0%～25%；++，阳性细胞率 > 25%～50%；+++，阳性细胞率 > 50%～75%；++++，阳性细胞率 > 75%～100%。0级定级积分为0，+积分为1，以此类推[10]。

2.7 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料以表示，采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 TMP对CIA大鼠足爪肿胀度的影响 与正常对照组比较，模型对照组足爪肿胀度明显增加（P < 0.01）；与模型对照组比较，治疗18 d后，TMP高剂量组及地塞米松组比模型对照组大鼠足爪肿胀度峰值降低，差异有统计学意义（P < 0.01）；

TMP低剂量组与模型组大鼠足爪肿胀度比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

3.2 TMP对CIA大鼠多发性关节炎指数的影响 与正常对照组比较，致炎后第14天开始，模型对照组多发性关节炎指数升高，差异有统计学意义

（P < 0.01）；治疗18 d后，TMP高剂量组及地塞米松组比模型对照组多发性关节炎指数下降，差异有统计学意义（P < 0.01）；TMP低剂量组与模型对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

3.3 TMP对CIA大鼠多发性关节炎滑膜细胞增殖的影响 MTT法研究显示，与正常对照组比较，模型对照组大鼠滑膜组织增殖明显升高（P < 0.01）；与模型对照组比较，地塞米松组与TMP高剂量组可降低OD值，提高抑制率（P < 0.01）；TMP低剂量组与模型對照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3。

3.4 TMP对CIA大鼠多发性关节炎滑膜细胞凋亡及p53的影响 碱性磷酸酶标记法和免疫组化法镜下观察滑膜细胞凋亡与p53表达积分显示：与正常对照组比较，模型对照组大鼠滑膜细胞凋亡积分明显下降、p53表达明显增高（P < 0.01）；与模型组比较，TMP高剂量组与地塞米松组大鼠滑膜细胞凋亡积分增高、p53表达下降（P < 0.01）；TMP低剂量组与模型对照组比较，滑膜细胞凋亡积分、p53表达差异无统计学意义（P > 0.05）。见表4。

4 讨 论

RA的病因及发病机制至今尚不清楚，但越来越多的证据表明破骨细胞的过度增殖、滑膜细胞凋亡障碍等在其发病中起着决定性的作用。RA关节软骨和骨组织的损害主要是由于滑膜细胞的活化和增生引起。滑膜细胞过度增生源于滑膜细胞凋亡的相对不足，RA患者滑膜细胞存在细胞凋亡过程的异常，这些异常可能与p53表达失衡及体内其他调节因素（如炎性细胞因子等）有关[11]。

FIRESTEIN等[12]发现，与肿瘤组织相似的p53异常表达在RA软骨侵蚀处的滑膜和培养的RA滑膜细胞存在。p53是一种抑制癌蛋白，它还可提供限制细胞生长和导致细胞凋亡的关键信号，是DNA修复和细胞复制的重要调节因子[13]。p53通过增加表达修复损伤的DNA，如损伤严重不能修复，则细胞凋亡，当p53发生异常表达时细胞凋亡受阻，导致细胞过度增生[14]；p53异常表达可能与RA滑膜组织慢性炎症致DNA损伤有关[15]；在RA病程中，p53异常表达可降低细胞凋亡的能力，促进滑膜细胞增殖，致关节损害[16]。AUPPERLE等[17]研究也表明，RA滑膜细胞p53蛋白存在异常表达，并证实p53蛋白是滑膜细胞凋亡的重要调节剂。因此，抑制滑膜细胞过度增生、促进其凋亡，有可能成为治疗这类疾病的一个有效途径。

TMP是中药川芎的有效成分之一，具有活血化瘀、理气、抗炎、止痛、抑制血小板聚集、改善微循环等作用，但其治疗RA的具体作用机制尚不十分明确。本研究结果显示，TMP（100 mg·kg-1）可明显降低足爪肿胀程度峰值，使关节炎指数下降（P < 0.01），对CIA大鼠的关节炎有明显疗效；与模型对照组比较，TMP（100 mg·kg-1）可降低OD值、提高抑制率。碱性磷酸酶标记法和免疫组织化学法结果显示，TMP（100 mg·kg-1）可明显增高细胞凋亡积分、下调p53表达，说明TMP

（100 mg·kg-1）对CIA大鼠关节炎的治疗作用可能与下调p53表达从而促进滑膜细胞凋亡有关。

综上所述，关节滑膜细胞是TMP发挥作用的主要靶细胞之一，对CIA大鼠具有明显的治疗作用，其机制可能是通过降低CIA大鼠滑膜细胞p53的表达水平，促进滑膜细胞凋亡，抑制关节滑膜细胞增殖，减轻局部慢性炎症反应，从而对CIA大鼠发挥治疗作用。

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