D-阿洛酮糖3-差向异构酶的异源表达和酶学性质

温宇威， 张 涛， 沐万孟， 江 波

（食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡 214122）

D-阿洛酮糖是D-果糖在C-3位置上的差向异构体，它在自然界中天然存在很少，并且价格昂贵。现在，越来越多的研究表明了D-阿洛酮糖是一种超低能量的糖。D-阿洛酮糖的甜度为蔗糖的70%，但能量吸收效率仅为蔗糖的0.3%[1-2]，而且它在消化道中几乎不被吸收[3]。因此，用它作为食品甜味剂在商业上很有潜力。近来，又有很多的生理研究表明D-阿洛酮糖具有很多生理功能，包括神经保护作用[4]、增强胰岛素耐受性[5-6]、抗氧化活性[7]、降低血糖和血脂[8-9]等。此外在食品加工过程中，在食品体系中添加D-阿洛酮糖可以起到提高凝胶性的作用，同时它还可以与食品体系中的蛋白质发生美拉德反应产生良好的化学风味[10]。由于D-阿洛酮糖在自然界中的来源很有限，而且化学合成难度大，因而越来越多的研究转向了利用微生物途径生产D-阿洛酮糖。

D-塔格糖3-差向异构酶家族酶能够催化己酮糖在C-3位置上发生差向异构化。它能够以相对便宜的糖为底物生成价格昂贵的糖，例如催化D-塔格糖生成D-山梨糖，催化D-果糖生成D-阿洛酮糖。日本香川大学的Izumori研究团队于1993年在Pseudomonas cichoriiST-24中发现了一种可以催化己酮糖C-3位差向异构化的酶，命名为D-己酮糖3-差向异构酶，因其最适底物为D-塔格糖，后重新命名为D-塔格糖3-差向异构酶[11]。此后，又有很多D-塔格糖3-差向异构酶家族的酶被发现。2009年，发现了来自Rhodobacter sphaeroidesSK011的R.sphaeroidesDTEas[12]；2011 年， 发现了来自Clostridium cellulolyticumH10的C.cellulolyticumDPEase[13]；2013 年，发现了来自Clostridium scindensATCC 35704 的C.scindensDPEase[14]；2014 年，发现了来自Clostridium bolteaeATCC BAA-613的C.bolteaeDPEase[15]。上述所报道的这些DTE家族酶都已经在大肠杆菌中被克隆表达，酶学性质也得到了广泛的研究。近几年，陆续又发现多种DTE家族酶，目前，对DTE家族酶的研究主要集中于发现新微生物来源的酶和对其酶学性质及晶体结构的探索，而利用DTE家族酶工业化生产D-阿洛酮糖却未见报道。

以大肠杆菌为宿主克隆表达DTE家族酶在工业应用上存在着很多的问题，低表达量、内毒素、形成包涵体以及目的蛋白质的错误折叠都是大肠杆菌表达系统的缺点[16]。枯草芽孢杆菌作为一种食品级表达宿主，越来越受到人们的青睐，主要有以下几个方面原因：1）是一种安全的表达系统；2）高效分泌目的蛋白质的能力；3）没有明显的密码子偏爱性，同时表达产物也不容易形成包涵体；4）转录、翻译、蛋白质折叠和分泌等信息已经被广泛研究；5）发酵条件简单，产物易于分离纯化。所有这些优势使得枯草芽孢杆菌成为了工业上生产酶的细胞工厂。当然，枯草芽孢杆菌作为外源基因的表达宿主也存在一些缺陷，主要包括分泌各种蛋白酶降解外源蛋白质和重组质粒的不稳定性[17]。

在本研究中，我们构建了以枯草芽孢杆菌为宿主，双启动子表达DTE家族酶的表达系统，以此来提高DTE家族酶的表达量。我们克隆了来源于Clostridium bolteaeATCC BAA-613的DPE基因，并在其上游插入了P43启动子，然后导入到B.subtilisWB800进行表达，并对重组酶进行了分离纯化和酶学性质的研究。本研究旨在实现DPE在食品级微生物枯草芽孢杆菌中的高效表达，为工业化酶法生产D-阿洛酮糖奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

E.coliDH5α和B.subtilisWB800：购于上海生工生物工程有限公司；克隆载体pMD19-T和表达载体pMA5：作者所在实验室保存；PCR引物：上海生工合成；DNA聚合酶、T4DNA连接酶、Nde I和Bam HI限制性内切酶：购自大连宝生物工程有限公司；D-阿洛酮糖标样：购自Sigma公司；其他试剂为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 目的基因Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DPE的扩增 基于Cb-dpe和P43启动子的基因序列，分别设计相对应的上下游引物对它们进行扩增，见表1。其中在P43上游引物P1和Cb-dpe下游引物P4的5’端引入Nde I和Bam HI酶切位点，在重组质粒3’端添加了6个组氨酸标签，方便后面的克隆操作和重组目的蛋白质的分离纯化。而且，P43的下游引物P2和Cb-dpe的上游引物P3有部分是反向互补的，这样在重叠延伸PCR的时候能将P43和Cb-dpe连接。

表1 PCR引物的序列Table 1 Oligonucleotides used for PCR

1.2.2 双启动子表达载体的构建 分别用引物P1、P2扩增出P43启动子，引物P3、P4扩增出Cb-dpe片段后，根据重叠延伸PCR的方法，将P43和Cbdpe混在一起作为混合模板，再用引物P1、P4扩增出P43-Cb-dpe片段。将PCR后的产物通过胶回收试剂盒回收并纯化目的片段，用T4连接酶将P43-Cb-dpe连接到克隆载体pMD19-T后，得到pMD19-T-P43-Cb-dpe载体，将其导入到E.coli DH5α中对其进行克隆扩增，然后提取质粒进行测序验证。在得到正确的测序结果后，用NdeI和BamHI双酶切 pMD19-T-P43-Cb-dpe和 pMA5，回收P43-Cb-dpe后利用T4连接酶将其连接到pMA5上，构建出pMA5-P43-Cb-dpe表达载体。最后，将pMA5-P43-Cb-dpe导入到宿主B.subtilisWB800中进行表达。

1.2.3 重组菌株的发酵培养 对于E.coli DH5α来说，其培养基是LB培养基，培养条件为37℃、200r/min。而对于B.subtilis WB800来说，先要在LB培养基中进行12 h的种子液培养，然后以3%的接种体积分数接种到发酵培养基中，其培养条件和E.coli DH5α的相同。E.coli DH5α的培养基在接种前需加入终质量浓度为100 μg/mL的氨苄青霉素，而B.subtilis WB800的培养基需加入终质量浓度为100 μg/mL的卡那霉素。

1.2.4 双启动子表达载体和单启动子表达载体的表达水平比较 将双启动子表达载体pMA5-P43-Cb-dpe和单启动子表达载体pMA5-Cb-dpe分别导入到宿主B.subtilis WB800中进行表达，相同条件下培养，在不同的发酵时间点取样测定菌体生长情况和酶活进行对比。

1.2.5 重组DPE的分离纯化 低温离心（8 000 g，10 min，4℃）发酵液收集菌体，然后以缓冲液（100 mmol/L NaCl，50 mmol/L PBS 钠盐缓冲液，pH 7.0）重悬菌体，超声波破碎重组B.subtilis WB800 8 min（300 W，开 1 s/关 2 s）后，低温离心（10 000 g，20 min，4℃）后弃去细胞碎片，收集上清液，并将上清液用0.45 μm孔径的醋酸纤维滤膜过滤，得到粗酶液。由于引入了6个组氨酸标签，因此采用Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow亲和柱对重组酶进行分离纯化。

在低温条件下，预先用5个柱体积去离子水冲洗层析柱，再用3～4个柱体积的Binding Buffer（500 mmol/L NaCl，50 mmol/L Na2HPO4，50 mmol/L NaH2PO4，pH 7.0）平衡层析柱，将粗酶液加入层析柱中，然后用 Wash Buffer（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，50 mmol/L Na2HPO4，50 mmol/L NaH2PO4，pH 7.0）洗去杂蛋白质，最后用 Elution Buffer（500 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪 唑 ，50 mmol/L Na2HPO4，50 mmol/L NaH2PO4，pH 7.0）洗脱得到酶液。用SDSPAGE电泳对纯化后的重组蛋白质进行检验。

1.2.6 重组Cb-DPE的酶活测定 整个酶反应体系为 1 mL，其中 D-果糖 50 g/L，CoCl21 mmol/L，重组酶1 μmol/L，PBS钠盐缓冲液 50 mmol/L，反应 10 min，然后煮沸5 min终止酶反应。

D-阿洛酮糖检测：将酶反应产物低温离心（4℃，12 000 r/min）30 min，取上清液用 0.22 μm 微滤膜过滤，稀释后进行HPLC检测。检测条件：Agilent 1260型高效液相色谱仪，Waters Sugar-Pak 1钙型阳离子交换柱，Shodex RI-101型示差折光检测器，以0.22 μm孔径的醋酸纤维滤膜过滤的纯水作流动相，流速0.4 mL/min，柱温85℃。

酶活单位U定义：在标准酶反应条件下，单位时间内酶催化D-果糖产生1 μmol的D-阿洛酮糖所需要的酶量定义为1个酶活单位。

1.2.7 重组Cb-DPE的最适反应温度及其稳定性将 1 mL 的酶反应体系分别置于 35、40、45、50、55、60、65、70℃条件下，参照1.2.5方法测定各组酶活，确定最适反应温度，并将酶活最高的一组设为相对酶活100%。

为了研究重组酶的热稳定性，将纯化后的酶液，分别在 30、40、50、60 ℃下保温，每隔半小时取样，测定残余酶活，定义初始酶活为相对酶活100%。

1.2.8 重组Cb-DPE的最适反应pH及其稳定性将 1 mL的酶反应体系分别置于 pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0条件下测定各组酶活，确定最适反应pH，并将酶活最高的一组设为相对酶活100%。实验中用到的两种不同的缓冲体系：磷酸盐缓冲溶液（pH 6.0～7.0）和 Tris-HCl缓冲溶液（pH 7.5～9.0）。

为了研究重组酶的pH稳定性，将纯化后的酶液分别在 pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 的缓冲液体中，低温（4℃）保持2 h，测定残余酶活，定义初始酶活为相对酶活100%。

1.2.9 不同种类金属离子和金属离子浓度对酶活的影响 为了研究金属离子对酶活的影响，首先在在低温条件下（4℃）将纯化好的酶液在透析液中透析6 h，螯合除去酶液中的金属离子。酶反应中添加不同种类的金属离子 （Co2+、Mn2+、Mg2+、Ni2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Ba2+）至终浓度 1 mmol/L，反应 10 min，然后煮沸5 min，终止酶反应。测定不同种类金属离子对酶活的影响，确定最适金属离子，并将酶活最高的一组设为相对酶活100%。

经试验确定最适金属离子后，设置不同金属离子浓度的反应体系，测定酶活，将酶活最高的一组设为相对酶活100%。

1.2.10 重组Cb-DPE的反应动力学常数研究 为了研究重组酶的反应动力学，分别以 5、7.5、10、15、20、50、100、200mmol/L 的 D-果糖和 D-阿洛酮糖作为底物，测定酶活，通过Lineweaver-Burk双倒数法作图，计算出重组酶的动力学参数：Km、Kcat、Kcat/Km。

2 结果与讨论

2.1 Cb-dpe和P43启动子的扩增

分别扩增出P43启动子和Cb-dpe基因后，利用重叠延伸PCR技术，以P43启动子和Cb-dpe基因为混合模板，再次利用引物P1和P4，将P43启动子插入到了Cb-dpe基因的上游，得到了P43-Cbdpe片段，琼脂糖凝胶电泳结果显示在1 200bp处出现了明显的扩增条带，见图1，与预期产物大小吻合。

图1 P43-Cb-dpe的扩增Fig.1 Agarose gel electrophoresis of P43-Cb-dpe amplification

2.2 双启动子表达载体的构建

在得到了P43-Cb-dpe片段之后，用T4连接酶将其连接到了pMD19-T载体上，导入到E.coli DH5α中对其进行扩增，然后提取质粒进行测序验证，结果表明扩增出的P43-Cb-dpe序列正确。之后，用 NdeI和 BamHI对 pMD19-T-P43-Cb-dpe和pMA5载体进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收P43-Cb-dpe目的片段，再次利用T4连接酶将其连接到pMA5载体上，构建出pMA5-P43-Cb-dpe表达载体。由于pMA5载体上本身自带有Hpa II启动子，因此，我们构建的pMA5-P43-Cb-dpe是一个双启动子的表达载体。对重组质粒进行Nde I和Bam HI的双酶切，得到pMA5载体的线性片段和插入的P43-Cb-dpe片段。琼脂糖凝胶电泳结果显示的两个条带大概分别为7 500 bp和1 200bp，见图2。与pMA5载体和P43-Cb-dpe大小相符，表明双启动子表达载体构建成功。最后将pMA5-P43-Cb-dpe导入到宿主B.subtilisWB800进行表达。

图2 pMA5-P43-Cb-dpe双酶切验证电泳图Fig.2 Identification of pMA5-P43-Cb-dpe by enzyme digestion

2.3 双启动子表达载体和单启动子表达载体的表达对比

与单启动子表达载体pMA5-Cb-dpe相比，双启动子表达载体pMA5-P43-Cb-dpe能够明显提高重组菌株的生长量和目的基因Cb-dpe的表达水平，见图3。在对数生长后期，双启动子表达载体pMA5-P43-Cb-dpe的发酵酶活为7.63 U/mL，比单启动子表达载体pMA5-Cb-dpe提高了36%。该结果表明，双启动子能够促进Cb-dpe在B.subtilis WB800中的高效表达。启动子是基因表达的重要元件，能够显著影响基因的表达。P43是来源于B.subtilis的组成型启动子，有较高的启动强度。在该启动子的调节下，目的基因在对数生长期和稳定期均可稳定表达[18]。

图3 pMA5-P43-Cb-dpe and pMA5-Cb-dpe的表达比较Fig.3 Enzyme activity and growth comparison of pMA5-P43-Cb-dpe and pMA5-Cb-dpe

2.4 重组DPE的分离纯化

对上述得到的重组菌株进行发酵，当菌体浓度达到一定值时离心收集菌体。超声破碎菌体细胞后再次离心，将得到的上清液过膜得到粗酶液。为了简化蛋白质纯化的步骤，我们在重组蛋白的C端引入了6个组氨酸标签，而组氨酸能够高度亲和Ni2+，因此可以使用Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow亲和色谱快速纯化目的蛋白质。然后将纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳检验，结果见图4。纯化的蛋白质大小约为34 000，与理论蛋白质相对分子量相吻合，证明了pMA5-P43-Cb-dpe在B.subtilis WB800成功表达。

图4 纯化后Cb-DPE的SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant Cb-DPE

2.5 重组Cb-DPE的最适反应温度及其稳定性

本研究通过测定在不同温度下的酶活力，得到了Cb-DPE的酶活——温度变化曲线，见图5。可以看出酶活随温度的变化特征非常明显，随着温度的上升，酶活经历了先上升再下降的过程，与之前描述的规律相符。55℃为该酶的最适温度，当温度超过60℃时，酶活急剧下降，在50～60℃之间，其相对酶活仍可维持在90%以上。

温度对酶促反应速率的影响表现在两个方面：一方面与一般化学反应一样，当温度升高时，反应速率加快；另一方面由于酶是蛋白质，随着温度升高，酶的变性速度加快，酶会因变性而失活，从而引起了酶反应速率的下降。酶反应的最适温度就是这两种过程平衡的结果。

图5 温度对Cb-DPE酶活力的影响Fig.5 Effect of temperature on Cb-DPE activity

Cb-DPE的热稳定性见图6。可以看出：30℃温育时，4 h后Cb-DPE的残余酶活仍然高于80%；40℃温育时，3 h后Cb-DPE的残余酶活仍然高于70%，这表明它在30～40℃范围内有良好的稳定性；50℃温育时，Cb-DPE的残余酶活急剧降低，在2.5 h以后残余酶活几乎为零；60℃温育时，残余酶活在1 h就已经消失。与大肠杆菌相比，枯草芽孢杆菌表达的DPE的热稳定性有所提高[15]。

图6 温度对Cb-DPE酶稳定性的影响Fig.6 Effect of temperature on Cb-DPE stability

2.6 重组Cb-DPE的最适反应pH及其稳定性

酶的生物学特征之一是它对酸碱的敏感性，这表现在酶的活性和稳定性易受环境pH的影响。pH对酶的活性的影响极为显著，通常酶只在一定的pH范围内才表现出活性，同一种酶在不同的pH值下所表现的活性不同，其表现活性最高时的pH值称为酶的最适pH。不同的酶在特定条件下都有它各自的最适pH。

pH对酶活的影响结果见图7。可以看出随着pH的上升，酶活呈现先上升后下降的趋势，在pH 7.0时酶活最高，和大肠杆菌表达的DPE一致[15]。工业化生产要求酶的最适pH为弱酸性，同时弱酸稳定性要强，因为在偏酸性条件下单糖异构化过程可以降低非特异性副反应以及褐变反应。Cb-DPE有较宽的pH作用范围，但是最适的反应pH仍在弱碱性范围（7.0～7.5），与期望的弱酸性pH范围仍有一定差距。

Cb-DPE的pH稳定性见图8。中性环境下，Cb-DPE有良好的pH稳定性。在pH 6.5～7.5的缓冲液中保持2 h后，残余酶活可在90%以上；而在偏酸性或偏碱性环境下，酶活损失较大。

各种酶因其氨基的组成和构象的不同，特别是因其作用中心构象和微环境的特殊性，酶分子只在一定的pH下保持稳定。不同的酶其pH稳定区域不同，有的酶只在稳定pH范围内的某一个pH区才有活性，超出了这个pH范围，酶活力将会大幅度降低。酶在过酸或过碱的环境中放置时间过长，都会导致不可逆的失活；当在偏酸或偏碱的环境中放置短暂的时间，虽然酶活力发生下降，但测定酶活时，在最适pH下测定，活力可以恢复到正常状态，这种pH的效应仅仅引起酶活性中心及微环境出现的可逆变化，但不导致整个酶分子构象出现不可逆的变化。

图7 pH对Cb-DPE酶活力的影响Fig.7 Effect of pH on Cb-DPE activity

图8 pH对Cb-DPE酶稳定性的影响Fig.8 Effect of pH on Cb-DPE stability

2.7 不同金属离子和金属离子浓度对酶活的影响

金属离子对酶的作用有两种，一是作为酶的辅助因子起作用，二是作为激活剂起作用。对于差向异构酶来说，金属离子通常与其活性中心的残基结合，具有稳定蛋白质空间结构的作用，是一种重要的辅基。已报道的DTE家族酶均表现出金属依赖性，只有在金属离子存在的情况下才有酶活。

不同金属离子对Cb-DPE酶活的影响见图9。以纯化后未经EDTA处理的原始酶为对照，可以看出不同的金属离子对酶活的影响有显著的不同，Mg2+和Zn2+对该重组酶的催化活性有明显抑制作用，而Co2+、Mn2+均呈现对酶催化活性增强的作用。有研究表明，金属离子在催化过程中能够锚定底物与酶的结合以及稳定生成的中间体的构象[19]。至于为什么只有Co2+和Mn2+对酶活有提高目前尚未得知。

图9 金属离子对Cb-DPE酶活力的影响Fig.9 Effect of different metal ions on Cb-DPE activity

由于Co2+的增强作用大于Mn2+，因此进一步考察不同浓度的Co2+对酶活的影响。图10呈现了Co2+浓度对酶活的影响，当体系中不存在Co2+时，Cb-DPE不表现出催化作用，这说明酶催化反应是依靠Co2+的；当在体系中添加Co2+的时候，酶催化反应速度急剧上升，并于0.4 mmol/L时达到最高，当Co2+浓度大于1 mmol/L时，随着Co2+浓度的上升，酶催化反应的速度趋于稳定。这可能是由于酶和金属离子的结合趋于饱和。

图10 Co2+浓度对Cb-DPE酶活力的影响Fig.10 Effect of Co2+concentration on Cb-DPE activity

2.8 重组酶的反应动力学常数研究

Km是酶的一个特性常数，其大小只与酶的性质有关，而与酶浓度无关。Km值可以判断酶的专一性和对底物的亲和性，有的酶可作用于多种底物，每种底物都有对应的Km值，其中Km值最小的底物称为该酶的最适底物。Kcat称之为催化常数，是指在底物浓度处于饱和状态下，每摩尔酶活性部位每秒钟转化为产物的底物的摩尔数，Kcat值越大，表示酶的催化速率越高。Kcat/Km是指在酶催化作用下，底物生成产物的表观二级速率常数，也称为专一性常数或催化效率。

重组Cb-DPE的动力学常数见表2。当以D-阿洛酮糖为底物时，其Km值为26.68 mmol/L，小于以D-果糖为底物时的61.80 mmol/L，这说明该酶对D-阿洛酮糖的亲和性更高，最适底物是D-阿洛酮糖；而且以D-阿洛酮糖为底物时，Cb-DPE的催化效率 Kcat/Km为 95.8 L/（mmol·min），大于以果糖作为底物时的 54.1 L/（mmol·min）。

表2 Cb-DPE的底物专一性和动力学常数Table 2 Relative activities and kinetic parameters of Cb-DPE for different substrates

3 结 语

扩增了来源于Clostridium bolteaeATCC BAA-613的DPE基因，利用重叠延伸PCR技术在目的基因上游加入P43启动子，扩增出P43-Cb-dpe，再将其连接到pMA5载体上成功构建出了双启动子表达载体pMA5-P43-Cb-dpe，以此来提高目的基因的表达水平。将重组质粒导入到食品级表达宿主B.subtilisWB800中进行表达，与单启动子表达载体相比，双启动子表达载体能够显著提高Cb-dpe的表达量。对目的蛋白质分离纯化后研究了其酶学性质，结果表明重组DPE的最适温度为55℃，最适pH为7.0，在温度30～40℃范围内和pH 6.5～7.5之间有良好的稳定性。Co2+、Mn2+可显著增强酶活。此外我们还研究了Cb-DPE的底物特异性，发现该酶对D-阿洛酮糖的亲和性比对D-果糖的高。而在动力学参数方面，以D-阿洛酮糖为底物时，Cb-DPE的催化效率Kcat/Km也更大。重组DPE的酶学性质与大肠杆菌表达的DPE相似，这表明DPE在枯草芽孢杆菌中的表达不会改变其酶学性质，为DPE食品级表达的工业化应用奠定了理论基础。

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