基于拉曼光谱的稻瘟病诊断

冷小梅， 谭 峰， 才巧玲， 薛龄季轩， 姜 珊， 李 冬

(黑龙江八一农垦大学信息技术学院，黑龙江 大庆 163319)

水稻是人类赖以生存的主要粮食作物之一，是中国粮食作物生产中不可或缺的一部分[1]。稻瘟病一直是水稻的重要病害之一，每年都有发生，严重时减产 40%～50%[2-6]。稻瘟病病菌的生命力极强，它可以在稻草和稻谷上过冬，在合适的环境下引起稻瘟病的发生[7]。

水稻稻瘟病检测常采用近红外光谱技术、多光谱成像技术、高光谱成像技术和图像处理等方法。刘飞等[8]、谭峰等[9]应用可见近红外光谱技术对水稻稻瘟病进行快速诊断。张浩等[10]利用多光谱成像技术对水稻穗颈瘟的严重程度识别进行了研究。杨燕[11]利用高光谱成像技术采集水稻稻瘟病植株图像，再应用数据图像处理方法对得到的稻瘟病图像进行特征提取，建立病害识别模型。袁建清等[12]基于高光谱成像技术对寒地水稻叶瘟病病征与缺氮病征识别进行了研究。近年来，农作物病害检测技术越来越多样化[13-14]。但这些检测技术实际操作难度较大，对环境要求严格，对样品的要求也非常复杂[15]。

拉曼光谱技术是当前比较新颖、快捷的一种检测方法，它既可以检测有机物也可以检测无机物，对于物质的气态、固态、液态等状态要求也不高[16-17]。对于具有相似分子结构的物质，利用拉曼光谱技术也可以检测出他们之间的差异，有效地区分分子结构之间的不同[18]。因此，本研究采集正常水稻和带有稻瘟病病菌的水稻植株拉曼光谱数据，对比分析有病害与无病害水稻植株细胞内部蛋白质、核酸、碳水化合物等的拉曼光谱差异，进而建立基于拉曼光谱的稻瘟病诊断方法。

1 材料与方法

2011-2014年从黑龙江省肇源县二站镇试验田中采集吉粳88水稻植株样品，用透明、密封、湿润的塑料瓶盛装以避免植株蒸腾失水。

选用DeltaNu公司生产的Advantage532型拉曼光谱仪，采用低功率5 mW配置。对无病害和有病害的水稻茎秆部位进行波段为200～3 400 cm-1的光谱采集，水稻茎部的拉曼特征峰敏感段也主要集中在 500～1 700 cm-1。对采集到的水稻茎部拉曼光谱进行预处理之后，利用Excel软件对数据进行初步分析，计算出样品的平均光谱，应用绘图软件Origin绘制图形。

对采集到的原始数据进行处理，利用Matlab编写的程序处理数据，得到样品光谱的峰值；通过拉曼光谱仪自带的光谱采集软件NuSpec software，对光谱数据进行采集和存档，数据连续自动地存为spc格式，光谱存为原始曲线；对数据库进行定量分析，以Grams PLSIQ软件制作的校正文件直接导入光谱仪软件中，得到光谱数据的多种表征，对得到的数据进行比较和计算。

2 结果与分析

2.1 水稻植株正常茎秆与稻瘟病发病茎秆的拉曼光谱差异

用拉曼光谱仪采集寒地水稻无病害与有病害植株茎部的 200～3 400 cm-1波段光谱。结果显示水稻植株茎部拉曼特征峰敏感段主要集中在 500～1 700 cm-1波段。对采集的数据利用Excel软件进行分析，得到水稻植株正常茎秆与稻瘟病发病茎秆的拉曼光谱整体对比图(图1)。

图1 水稻植株正常茎秆与稻瘟病发病茎秆的拉曼光谱整体对比图Fig.1 Overall comparison chart of Raman spectra of normal stems and stems infected by rice blast of rice plants

拉曼特征峰的位移分为红移和蓝移，红移表示从高频率移到低频率，蓝移表示从低频率移到高频率。从图1中可以看出正常茎秆波数562 cm-1的拉曼特征峰红移到发病茎秆中的556 cm-1处，说明主链中酰胺VI的C=O变形能量降低，C=O双键变长且相互作用的双键能力变弱，同时也代表蛋白质肽键变弱。蛋白质侧链中的苯丙氨酸残基特征峰由1 615 cm-1蓝移到1 619 cm-1处，使得苯丙氨酸残基的振动能量增加，进一步表明发病茎秆中蛋白质的种类、空间结构发生明显变化。DNA中碱基腺嘌呤特征峰由726 cm-1处蓝移到730 cm-1，说明碱基中的腺嘌呤含量增加，同时说明DNA中碱基组织成分发生变化。碳水化合物中单糖拉曼特征峰由1 072 cm-1蓝移到1 076 cm-1，说明葡萄糖、D-甘露糖、葡萄糖醛酸3种单糖中至少有1种单糖的化学键振动能量增加，连接的化学键相互作用增强；碳水化合物中的纤维素拉曼特征峰由1 446 cm-1红移到1 440 cm-1处，说明多糖中纤维素化学键振动能量降低，进一步证明了稻瘟病发病茎秆中碳水化合物成分、结构出现异常。为了更加清晰地对比分析稻瘟病发病茎秆与正常茎秆拉曼特征峰数量的变化，将2株水稻植株拉曼光谱的相对强度进行细化(图2)。

图2 水稻植株正常茎秆与稻瘟病茎秆拉曼光谱对比图Fig.2 The comparison chart of Raman spectra of normal stems and stems infected by rice blast of rice plants

对比图2中稻瘟病发病茎秆与正常茎秆的拉曼光谱可以发现，在642 cm-1处发病茎秆的拉曼光谱没有出现波峰，说明此处的酪氨酸特征峰消失了。而发病茎秆中DNA在1 328 cm-1处的胸腺嘧啶特征峰也消失了，说明胸腺嘧啶发生了强烈的化学变化，进一步说明稻瘟病病菌的侵染造成水稻组织内蛋白质、核酸、碳水化合物等分子结构发生变化。

从图3中可以看出，水稻稻瘟病发病茎秆在527 cm-1处的拉曼特征峰是由发病叶片中526 cm-1处的特征峰蓝移得到的，说明蛋白质侧链在此处的S-S键振动加强，相互作用增强。而稻瘟病发病茎秆在631 cm-1处的拉曼特征峰是由发病叶片在636 cm-1处的特征峰红移得到的，说明蛋白质侧链中的苯丙氨酸残基的化学键振动能量减弱，即残基间相互作用减弱，进一步说明当稻瘟病病菌侵入水稻茎部时，组织中蛋白质结构发生异常。

图3 水稻植株稻瘟病发病叶片和茎秆拉曼光谱的整体对比图Fig.3 Overall comparison chart of Raman spectra of leaves and stems of rice plants with rice blast

水稻稻瘟病发病茎秆拉曼光谱中在810 cm-1处存在RNA磷酸二酯PO2的特征峰，然而在发病叶片光谱中此处的特征峰消失，说明RNA结构发生变化。发病茎秆在1 099 cm-1处的特征峰是由发病叶片在1 095 cm-1处的特征峰蓝移得到的，说明DNA中骨架磷酸之间的化学键振动能量增强，相互作用增强。也说明随着稻瘟病病菌的侵染，水稻稻瘟病发病茎秆中RNA和DNA骨架磷酸发生变化。发病茎秆在1 215 cm-1处的拉曼特征峰是由发病叶片在1 223 cm-1处的特征峰红移得到的，说明DNA中碱基腺嘌呤含量减少，化学键之间相互作用减弱。而发病茎秆在1 583 cm-1处的拉曼特征峰是由发病叶片在1 586 cm-1处的特征峰红移得到的，说明在DNA碱基鸟嘌呤和腺嘌呤中至少有一种物质的化学结构发生变化。也进一步说明在受到稻瘟病病菌入侵的情况下，DNA中碱基结构发生了改变。发病茎秆中在1 111 cm-1处的拉曼特征峰消失，说明此处不存在D-甘露糖。发病茎秆在1 350 cm-1处的拉曼特征峰是由发病叶片在 1 356 cm-1处的特征峰红移得到的，说明此处葡萄糖和葡萄糖醛酸中至少有一种物质的化学键发生断裂。也说明稻瘟病病菌侵染对碳水化合物中单糖的影响。发病茎秆在1 366 cm-1处的拉曼特征峰是由发病叶片在1 364 cm-1处的特征峰蓝移得到的，说明此处多糖中的葡聚糖的化学键相互作用增强。发病茎秆在1 449 cm-1处的拉曼特征峰是由发病叶片在1 457 cm-1处的特征峰红移得到的，说明此处纤维素中化学键之间的相互作用减弱，也说明稻瘟病病菌侵染使碳水化合物分子结构发生变化。

由图4可见，发病叶片在846 cm-1处的拉曼特征峰在发病茎秆光谱中消失，说明发病茎秆中酪氨酸的对羟苯基环化学键全部断裂。发病叶片在1 678 cm-1处存在1个拉曼特征峰，而发病茎秆在此处存在2个非常小的拉曼特征峰，说明酰胺Ⅰ中β-折叠化学键振动能量变弱，β-折叠化学键之间的相互作用变弱。从图4中还发现，在发病叶片光谱1 520 cm-1附近仅存在1个拉曼特征峰，而在发病茎秆光谱中存在3个小的拉曼特征峰，说明C=C双键在此处的伸缩振动能量十分微弱，化学键断裂十分严重且化学键之间的相互作用也十分脆弱。

图4 水稻植株稻瘟病发病叶片和茎秆拉曼光谱的对比图Fig.4 Comparison chart of Raman spectra of leaves and stems of rice plants with rice blast

2.2 水稻植株稻瘟病发病茎秆的拉曼频率点变化

从500～1 700 cm-1波数范围内挑选32个拉曼频率点绘制散点图(图5)。从图5中可以看出这32个拉曼频率点的变化，整体来说发病茎秆的拉曼特征峰相对强度更加平稳，特别是871 cm-1、1 001 cm-1、1 153 cm-1、1 520 cm-14处的拉曼特征峰值发生了变化。在871 cm-1处蛋白质中的色氨酸的吲哚环含量降低，说明吲哚环遭到破坏；在1 001 cm-1处甲基(-CH3)的含量减少，说明-CH3的平面摇摆振动几乎没有发生；在1 153 cm-1处C-C单键含量减少，并且其右侧半峰1 189 cm-1处的C-N 键几乎全部断裂；在1 520 cm-1处C=C双键含量减少，且C=C 双键的伸缩振动也在减弱。这几处峰值的变化都充分说明在稻瘟病病菌的侵染下，水稻茎秆内蛋白质的多级结构和生理功能均出现异常。

图5 水稻植株稻瘟病发病茎秆拉曼频率点散点图Fig.5 Raman scatter plot of infected stems of rice plants with rice blast

2.3 采用ROC曲线方法诊断水稻稻瘟病

用Spss统计软件对稻瘟病发病茎秆和正常茎秆的拉曼光谱进行2个独立样本的t检验分析，结果显示有显著差异(P<0.05)。发现539 cm-1、793 cm-1、1 055 cm-1、1 364 cm-1特征峰强度(I539 cm-1、I793 cm-1、I1 055 cm-1、I1 364 cm-1)等在正常水稻茎部与稻瘟病发病组织中差异性不大，而I511 cm-1、I621 cm-1、I969 cm-1、I1 109 cm-1、I1 446 cm-1等在正常水稻茎部与稻瘟病发病组织中存在明显差异。在此基础上运用受试者工作特征曲线(ROC曲线)方法，对比正常水稻茎秆与稻瘟病发病茎秆拉曼谱线的灵敏度与特异性。如果曲线面积(AUC)>0.6，则说明具有显著的诊断性，AUC越接近1.0，则说明诊断性越高。选择7个具有代表意义的特征峰绘制ROC曲线(图6)。

图6中I1 154 cm-1曲线与I1 520 cm-1曲线由横轴零点直接达到纵轴的最高点1.00的位置，曲线下的面积AUC=1.00，说明发病茎秆在1 154 cm-1和1 520 cm-1特征峰处C-C和C=C几乎全部断裂，或者说不存在C-C键和C=C双键。I523 cm-1曲线在横轴的0.33和0.67处有2个折点，曲线下面积AUC=0.86，说明发病茎秆在此处的S-S键变长，S-S键的扭曲-扭曲-反式构象变弱。I1 001 cm-1曲线在横轴的0.67处出现折点，曲线面积AUC=0.97，说明发病茎秆在此处的甲基(-CH3)化学键断裂十分明显。I1 189 cm-1曲线在横轴的0.33处出现折点，曲线面积AUC=0.94，说明发病茎秆在此处大部分的C-N键断裂，且C-N键的伸缩振动十分微弱。I1 556 cm-1曲线在横轴的0.17、0.33、0.83处出现折点，曲线面积AUC=0.97，说明发病茎秆在此处的色氨酸吲哚环之间相互作用的化学键减弱。I1 584 cm-1曲线在横轴的0.33处出现折点，曲线面积AUC=0.83，说明发病茎秆在此处的DNA发生异常，鸟嘌呤和腺嘌呤中至少有1种物质发生改变。

图6 正常水稻植株与稻瘟病发病茎秆的ROC曲线Fig.6 Receiver operating characteristic(ROC) curve of normal rice plants and infected stems of rice plants with rice blast

3 结 论

本研究尝试将受试者工作特征曲线(ROC曲线)方法应用在水稻稻瘟病检测。首先从蛋白质、核酸、碳水化合物方面对水稻茎部拉曼光谱在871 cm-1、1 001 cm-1、1 153 cm-1、1 520 cm-1处进行典型峰值的确认，根据C-C键、C=C键以及C-N键等化学键振动频率的不断减弱，以及DNA分子中腺嘌呤、鸟嘌呤等的结构异常，对水稻茎部进行稻瘟病诊断,选择7个特征峰绘制ROC曲线，曲线下面积(AUC)最小为0.83，说明诊断性较明显。其次利用Spss统计软件对正常水稻茎秆及稻瘟病发病茎秆和叶片的拉曼光谱进行统计分析，通过对比两者拉曼谱线在位移、峰数以及相对强度上的变化，判断稻瘟病发病水稻植株内分子结构的改变，为稻瘟病早期检测提供依据。

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