黄瓜绿斑驳花叶病毒 CP基因克隆及亚细胞定位

范小燕， 杨 柳， 季英华， 任春梅， 缪 倩， 韩玉春， 章松柏， 程兆榜， 鲁红学

(1.长江大学农学院，荆州 434025； 2.江苏省农业科学院植物保护研究所/江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培养基地，南京 210014； 3.海南出入境检验检疫局热带植物隔离检疫中心，海口 570311)

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus, CGMMV)是一种重要的植物病毒，主要危害西瓜、黄瓜、葫芦、甜瓜、丝瓜、苦瓜等葫芦科作物，自1935年英国科学家Anisworth[1]首次在黄瓜上报道该病毒以来，欧洲、亚洲、南美洲、北美洲以及中东的30多个国家和地区陆续出现CGMMV产生危害的报道[2]，对当地瓜果类作物生产造成了严重的威胁。CGMMV可以侵染多种葫芦科作物，不同作物上的症状表现不尽相同，但都对作物产量和品质影响极大[3-6]。在中国CGMMV于2005年在广西观赏南瓜上首次被发现[7]，目前已扩散至辽宁、河北、湖北、湖南、广东、山东、江苏、甘肃等地[8-10]。鉴于该病毒的危害性，2006 年中华人民共和国农业部第788 号公告正式将 CGMMV 列入农业植物检疫性有害生物名录。

CGMMV是杆状病毒科(Virgaviridae)烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的重要成员，可通过带毒种子、农事操作、病残体及授粉等多种方式传播[11]，病毒粒子为大小约300 nm×18 nm的直杆状颗粒，基因组全长约6 400 bp，两端各有一个非编码区，中间包括4个开放阅读框(Opening read fragment，ORF)[12]，分别编码17 300外壳蛋白(Coat Protein，CP)、29 000移动蛋白(Movement Protein，MP)、129 000和186 000复制蛋白[13-14]。

在黄瓜绿斑驳花叶病毒同属(烟草花叶病毒属)成员中，很多研究结果表明CP作为病毒的结构蛋白，在病毒颗粒的组装过程中起着十分重要的作用，同时CP还参与了病毒运动，病毒致病过程中症状的形成，合成负链RNA过程中烟草花叶病毒(TMV)复制酶的位点识别，病毒复制复合物(Virus replication complexes, VRCs)的调控等[15-19]多项功能的行使，这些结果表明CP在病毒的侵染循环中起着重要作用。

CP是病毒结构蛋白[20]，Park等[21]研究发现转CP基因的西瓜对CGMMV有较好抗性，Zhang等[22]研究发现CGMMV CP蛋白第96位氨基酸对病毒的侵染起重要作用，这些结果暗示CGMMV的CP蛋白可能参与了病毒侵染过程中的多项生命活动。因此，对CGMMV CP蛋白深入研究，将有助于了解其功能，揭示CGMMV致病机理，也为后续CGMMV的有效防控提供新的思路。

研究蛋白质的亚细胞定位有助于研究其功能[23]。Yang等[24]在研究番茄金色花叶病毒(Tomatogoldenmosaicvirus，TGMV)的AL2蛋白时发现，AL2在细胞质和细胞核均有分布，与其激活病毒转录及抑制寄主的基因沉默功能对应。潘江杰[25]在研究水稻白化致死基因时，发现ABD基因定位于叶绿体中并参与了叶绿体发育、叶绿素合成降解及光合作用等调节，而突变体abd影响其叶绿体定位及功能，表现白化症状。姬金花[26]在研究佩梅病毒的PLP1基因功能时发现PLP1点突变会导致其编码的蛋白质无法在内质网中正确折叠并转运，造成蛋白质及内质网和细胞的特殊反应，最终引发佩梅病。这些结果表明蛋白质正常行使功能离不开其在细胞内的特定分布特征，因此针对蛋白质的亚细胞定位展开研究也将有利于推动蛋白质功能的解析。

本研究选择近年来在中国瓜类作物上肆虐危害的CGMMV江苏分离物作为研究对象，通过设计特异性的引物，克隆其CP基因的全长序列，并构建带有YFP标签的重组表达质粒CP-YFP，转化农杆菌后在本氏烟(Nicotianabenthamiana)叶片表皮细胞中进行瞬时表达，通过激光共聚焦显微镜观察研究CGMMV编码的CP蛋白的亚细胞定位特征，为后续CGMMV CP的功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试CGMMV毒源为2012年采自江苏洪泽的西瓜分离物[27]，Taq酶、pMD18-T 载体及限制性内切酶均购自 TaKaRa 公司，大肠杆菌Trans10感受态购自北京全式金生物公司，农杆菌GV3101为实验室保存菌株，35S∶YFP载体由南京农业大学陶小荣教授惠赠，植物材料本氏烟为实验室保存，种植于实验室光照培养箱中。RNA提取试剂盒(Plant RNA Kit)购自OMEGA公司，反转录试剂盒(Prime ScriptTM1st strand cDNA Synthesis Kit)与T4 DNA连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司，DNA 凝胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自爱思进生物技术有限公司，羊抗兔 IgG及绿色荧光蛋白抗体(THETMGFP Antibody)购自南京金斯瑞生物科技有限公司，ECL Western Blotting Substrate显色试剂盒购自上海天能科技有限公司，引物合成及序列测定均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。序列比对等分析处理采用Clustal X、Bioedit、DNAstar等软件完成。

1.2 总RNA的提取及cDNA的合成

取0.1 g 病叶于液氮中速冻研磨，按试剂盒说明书提取总RNA。取500 ng RNA为模板，加入1 μl Oligo dT，1 μl 随机引物和1 μl dNTP，按反转录试剂盒说明书操作获取cDNA反应产物于-20 ℃保存备用。

1.3 CP基因克隆及其序列分析

根据CGMMV基因组序列设计CP全长扩增引物CGCP_BH1F：CGGGATCCATGGCTTACAATCCGATCAC (含BamHⅠ酶切位点)和CGCPbr：CGGGATCCAGCTTTCGAGGTGGTAGC，以500 ng cDNA为模板，进行PCR扩增。反应体系25 μl，反应条件：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 45 s，52 ℃退火 45 s，72 ℃延伸1 min，30 个循环；最后72 ℃充分延伸 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，按胶回收试剂盒说明书操作回收目的片段，连接到 pMD18-T 载体并通过热激法将连接产物转入大肠杆菌Trans10 中，转化产物涂布于含氨苄青霉素的LB平板，37 ℃培养箱中倒置培养过夜至菌落长出，菌落PCR和酶切鉴定阳性克隆，经测序验证无误后获得阳性克隆pMD18T-CP用于后续试验。

1.4 CP-YFP载体构建

按照质粒提取试剂盒说明书操作提取pMD18T-CP质粒后进行酶切，酶切体系：1 μlBamHⅠ，4 μl 10×T Buffer ，20 μl pMD18T-CP质粒，ddH2O定容至40 μl。37 ℃酶切3 h。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳后胶回收试剂盒回收目的片段，将回收的目的片段通过T4连接酶连接到同样经BamH I酶切回收的线性化35S∶YFP载体，连接体系：目的片段回收产物7 μl ，1 μl T4 DNA 连接酶，1 μl 10×T4 DNA 连接酶缓冲液，1 μl 线性化35S∶YFP载体，16 ℃过夜连接。热激法将连接产物转入大肠杆菌Trans10，菌落PCR扩增和酶切鉴定阳性克隆，测序验证无误后获得阳性克隆CP-YFP用于后续试验。

1.5 CP亚细胞定位观察

利用电击法将构建好的CP-YFP 重组质粒转入农杆菌GV3101，以35S∶YFP空载体为对照，经卡那霉素和利福平抗性平板筛选培养，最后通过菌落PCR 鉴定阳性克隆。

将转入CP-YFP及35S∶YFP空载体的农杆菌于含利福平及卡那霉素的液体培养基中，28 ℃，220 r/min，过夜培养至OD600为0.8～1.2；8 000 r/min 10 min收集菌体。用浸润液(10 mmol/L 氯化镁，10 mmol/L 2-吗啉乙磺酸，100 μmol/L 乙酰丁香酮)将重组农杆菌菌体悬浮至OD600约0.5，28 ℃避光静置2 h，使农杆菌复苏[28]。选取4～6叶龄健康本氏烟叶片进行浸润，40 h后切取浸润区本氏烟叶片于激光共聚焦显微镜(ZEIZZ LSM710)488 nm激发光下观察目标蛋白的表达情况及其亚细胞定位特征。

细胞核染色采用DAPI法：在制好的玻片上滴加适量DAPI染液(100 ng/ml)，避光染色10 min，流水冲去染液，于激光共聚焦显微镜 360～400 nm激发光下观察。

1.6 总蛋白质抽提与免疫印迹试验

浸润处理40 h后，称取 0.4 g浸润区叶片，加入1 ml 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS)，冰上研磨后转移至离心管中，漩涡震荡混匀，12 000 r/min离心15 min，取上清液，加入适量聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)5×上样缓冲液，沸水煮10 min，-20 ℃保存。

取适量蛋白质样品于12% SDS-PAGE凝胶电泳分离，在电转移缓冲液中通过湿转转膜仪将蛋白质转至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上(260 mA 恒流电泳1 h)，取出PVDF膜，用含0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBST)漂洗3次，每次5 min，将膜浸入封闭液中(5%脱脂奶粉)，120 r/min摇动封闭1 h，PBST漂洗3次，每次5 min，将GFP抗体以1∶5 000稀释于PBST中，浸没PVDF膜，4 ℃保温过夜，PBST漂洗3次，每次5 min，将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗以1∶2 000稀释于PBST中，浸没PVDF膜，室温结合1 h，PBST漂洗3次后，用ECL化学发光试剂盒显影。

2 结果与分析

2.1 CGMMV CP基因克隆

以病样总RNA为模板，利用CGMMV外壳蛋白特异性引物CGCP_BH1F和CGCPbr 进行RT-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物发现有一条大小约500 bp的特异性条带(图1a)，与预期的目标大小(486 bp)基本一致，说明该条带就是本研究要扩增的目的基因条带。利用DNA凝胶回收试剂盒回收该目的片段，将目的片段连接克隆载体pMD18-T，转化Trans 10感受态细胞。利用菌落PCR及酶切验证(图1b)筛选阳性克隆，获得的阳性克隆菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序验证无误后，从而获得重组阳性质粒pMD18T-CP。

2.2 序列特征分析

分析获得的CGMMV江苏分离物的CP基因碱基序列，发现其全长486 bp，编码一个161个氨基酸大小约17 500的蛋白质，与之前报道的江苏分离物(KC852073)CP基因碱基序列完全一致(图2)。

本研究对已报道的CGMMV其他分离物编码的CP蛋白氨基酸序列进行分析，结果发现本研究获得的CGMMV江苏分离物编码的CP蛋白氨基酸序列除与之前报道的江苏分离物序列完全一致外，与中国山东分离物、辽宁分离物、广西分离物、河北分离物、台湾分离物的蛋白质氨基酸序列都完全一致，不仅如此，它与印度分离物、韩国分离物、日本分离物及一个俄罗斯分离物(GQ495274)的序列也完全一致(图2)。表明CGMMV编码的CP蛋白是一个相对比较保守的蛋白质，选用CGMMV江苏分离物进行研究具有很好的代表性。

a：CGMMV CP基因RT-PCR扩增；b：PMD18T-CP酶切验证(Bam H I)。图1 CGMMV编码的CP基因RT-PCR扩增及克隆Fig.1 PCR amplification and cloning of CGMMV CP gene

图2 CGMMV CP蛋白氨基酸序列分析结果Fig.2 The sequence analysis of CGMMV CP protein

2.3 CP-YFP载体构建

利用基因克隆时引入的BamH I酶切位点，通过BamH I酶切pMD18T-CP获得了两条片段，其中一条大小在2 000 bp和3 000 bp之间(pMD18-T)，另一条大小约500 bp，与486 bp 的CP大小基本一致(图1b)，利用DNA凝胶回收试剂盒回收大小约500 bp的CP片段，通过T4连接酶将该目的片段连接到BamHⅠ处理后纯化回收的YFP空载体质粒，转化Trans 10感受态细胞。鉴于CP基因是经单酶切(BamH I)插入35S∶YFP载体，因此CP可以正向插入，亦可反向插入，为了保证插入方向正确，本研究在筛选阳性克隆时引入了一条位于35S启动子区域的引物(35SF)，该引物与CP基因扩增引物的R端引物配对进行菌落PCR筛选(图3)，筛选到的阳性克隆进一步进行酶切鉴定(BamH I)，酶切产物琼脂糖凝胶电泳后，有大小两条带：一条大小在15 000 bp 左右(35S∶YFP载体)，另一条大小约500 bp，与CP目的片段大小一致。表明融合YFP标签的CP重组表达载体CP-YFP构建成功。

a：CP-YFP载体构建示意图；b：CP-YFP酶切验证；c：CP-YFP PCR验证图。图3 CP-YFP载体构建Fig.3 Construction of CP-YFP vector

2.4 CP蛋白亚细胞定位分析

将构建好的CP-YFP质粒通过电击法转入农杆菌GV3101，经浸润液处理后接种本氏烟(Nicotianabenthamiana)叶片，在激光共聚焦显微镜下观察发现接种40 h后，浸润CP-YFP的本氏烟叶片细胞中有明显的荧光信号，荧光除了在细胞质有分布外，在细胞核也疑似有分布，为了进一步印证其在细胞核的分布，本研究采用DAPI处理细胞核后进行观察，结果发现二者在细胞核存在重合(图4)。表明CP在本氏烟表皮细胞的细胞质及细胞核均有分布。

a：对照组YFP亚细胞定位；b：带YFP标签的CP蛋白亚细胞定位(小图示意CP在细胞核内分布)。图4 CP蛋白亚细胞定位Fig.4 Subcellular localization of CP protein

2.5 CP-YFP的表达检测

为了进一步印证CP-YFP在本氏烟叶片细胞中的表达，同时排除空载体等因素的干扰，本研究以GFP抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗检测本氏烟中YFP和CP-YFP的表达。Western-blot结果显示，接种CP-YFP的本氏烟样品在接近48 000处有特异性条带出现，与预期的CP-YFP融合蛋白大小44 000基本吻合；而接种YFP的本氏烟样品在 25 000～35 000有明显条带，与YFP大小27 000相吻合(图5)。表明浸润接种的CP-YFP在本氏烟叶片细胞中成功表达，同时也印证了激光共聚焦显微镜下观察到的本氏烟叶片细胞中的荧光信号是由CP-YFP在烟草叶片中顺利表达产生的。

图5 免疫印迹法检测YFP及CP-YFPFig.5 Detection of YFP and CP-YFP by Western blot

3 讨 论

CGMMV是一种主要侵染葫芦科作物的重要病毒，由于其对西瓜、黄瓜等作物造成的严重损失，已被世界多个国家和地区列为检疫性有害生物，成为困扰产业健康发展的重要因素之一。本研究选择2012年采自江苏洪泽的CGMMV西瓜分离物作为研究对象，对其CP基因进行了克隆和序列测定，结果发现CP基因全长486，编码一个17 500的蛋白质，与中国山东、辽宁、广西、河北、台湾等其他分离物序列完全一致(序列相对保守)，为进一步研究其亚细胞定位特征，本研究构建了带有YFP荧光标签的重组表达载体CP-YFP，转化农杆菌后浸润接种本氏烟，结果发现CP在细胞质及细胞核中均有分布，为后续进一步研究CGMMV CP功能奠定了基础。

在烟草花叶病毒属典型成员TMV的研究中也有报道显示CP在细胞质有分布，如早年Martin[29]在研究TMV时发现在细胞质存在大量病毒粒子，而CP是TMV的结构蛋白，暗示了CP在细胞质有分布。Hills[30]在利用免疫胶体金技术研究TMV编码蛋白质定位时证实CP在细胞质有分布。Bendahmane等[31]在利用BY-2原生质体研究TMV时，也发现CP在细胞质内有分布。彭浩然等[32]在利用激光共聚焦显微镜研究番茄花叶病毒(ToMV)编码的CP蛋白时发现CP在细胞质有分布，由于烟草花叶病毒属内很多病毒的复制、转录、组装等一系列重要的生命活动大都是在细胞质内完成的[33-35]，因此CP的细胞质定位特征与这些功能研究结果相吻合。在本研究确定CGMMV编码的CP在细胞质中有分布，暗示了CGMMV编码的CP在细胞质中可能参与了这些功能的行使。

本研究结果表明，CGMMV编码的CP除了在细胞质有分布外在细胞核也有分布，而在同属TMV的研究中，Honda等[36]在利用电镜观察病样切片时发现细胞核中存在病毒粒子形成的聚合体。Hirai等[37]在研究TMV侵染特征时发现在TMV侵染早期(6～18 h)，病毒外壳蛋白会在细胞核中积累。Reddi[38]在研究中也发现了类似的现象。杜利娟[39]在利用激光共聚焦显微镜研究TMV及TuMV编码的CP蛋白亚细胞定位时发现二者在寄主细胞核也有分布。这些结果表明病毒的CP在细胞核也有分布，但是CP在细胞核内的功能目前还未见相关报道，因此针对其核定位特征研究其相关功能，可能有助于更深入解析病毒的致病机理，为病毒的有效防控提供新的思路。

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