Fh8明显增强PCV2 Cap蛋白的可溶性表达及抗原性

郭芸芸， 张碧成， 孙小涵， 汪 伟， 何孔旺， 牛家强， 张雪寒

(1.江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/江苏省食品质量安全重点实验室——省部共建国家重点实验室培育基地，江苏 南京 210014； 2.西藏农牧学院动物科学学院，西藏 林芝 860000)

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)可导致断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)，它是猪圆环病毒家族中重要的成员，也是猪群中最常见的猪圆环病毒型[1-4]。

PCV2是环状、单股负链DNA 病毒，病毒基因组包含有11 个开放阅读框(Open reading frame，ORF)[5]。ORF2主要编码Cap蛋白，Cap蛋白分子量大小约27 800，由233～234个氨基酸构成，该蛋白是PCV2唯一的结构蛋白，与猪圆环病毒2型的感染与免疫有着密切关系[6]。因此，Cap蛋白是研发PCV2疫苗和PCV2检测试剂的靶标蛋白[7-9]，但其体外表达的可溶性严重制约Cap蛋白的应用。

Fh8是肝片吸虫在感染早期分泌的蛋白，因其分子量为8 000，故命名为Fh8[10-12]。Fh8融合标签是高效的蛋白可溶性表达增强子，它的分子量小，相比现有的大融合标签具有先天优势。

以PCV2基因组DNA为参照，获得ORF2基因，克隆到含有Fh8标签的大肠杆菌表达载体中，实现Cap蛋白的可溶性表达，免疫小鼠评估其免疫原性，为PCV2防控制剂的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

PCV2b 基因型的强毒株，由江苏省农业科学院兽医研究所自行分离、鉴定、保存，病毒滴度为1 ml 106.25TCID50。pCold-Fh8表达质粒，由江苏省农业科学院兽医研究所自行构建和保存。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、T4 DNA连接酶、限制性内切酶，购买于 TaKaRa 公司。质粒提取试剂、胶回收试剂盒，购买于Axygen 公司。DH5α和BL21感受态细胞，购买于南京助研生物科技公司。猪抗PCV2多克隆抗体和HRP-羊抗猪IgG，分别购买于VRDM和 BETHYL公司。

1.2 获得优化的PCV2 ORF2基因片段

根据 GenBank已有PCV2ORF2基因序列(登录号：KC153106.1)，参照大肠杆菌偏爱的密码子优化ORF2的稀有密码子，并在基因序列的5′端和3′端分别添加酶切位点，优化的ORF2基因由南京金斯瑞生物技术有限公司合成，克隆入 pUC57载体，获得重组质粒 pUC57-ORF2。

1.3 构建重组质粒

将上述重组质粒pUC57-ORF2和表达载体pCold-Fh8分别用XhoⅠ与EcoR Ⅰ酶切。酶切产物经回收，再与pCold-Fh8连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布LB 平板(氨苄青霉素，100 μg/ml)，37 ℃过夜培养。次日，挑取单菌落接种含有氨苄青霉素的液体 LB，继续37 ℃过夜培养，双酶切鉴定质粒，阳性质粒命名为 pCold-Fh8-Cap。同时构建3个对照重组质粒pCold-Cap、pCold、pCold-Fh8。

1.4 构建重组菌和诱导表达

1.4.1 重组菌的构建 将上述重组质粒转化大肠杆菌BL21，涂布LB 平板(氨苄青霉素，100 μg/ml)。过夜培养，挑取单菌落，酶切鉴定，获得重组菌株pCold-Fh8-Cap/BL21、pCold-Cap/BL21、pCold /BL21和pCold-Fh8/BL21。

1.4.2 重组菌的诱导表达 上述的重组菌首先接种LB液体培养基，37 ℃振荡培养。次日，再以1%比例转接新鲜的LB液体培养基，37 ℃振荡培养 2～3 h后，加入终浓度为 0.1～0.5 mmol/L 的IPTG，16 ℃继续培养 18～24 h，收获细菌。

1.5 SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定

1.5.1 SDS-PAGE分析 上述诱导培养物，各取1 ml，8 000 r/min离心10 min，收集菌体，用1/5体积的TE(pH为8.0)缓冲液重悬，SDS-PAGE分析表达情况。

1.5.2 Western blotting鉴定 常规方法进行半干式转印，然后将转印有Cap蛋白的转移膜放入含有5%脱脂乳的盒子中，过夜震摇孵育。次日，弃去脱脂乳，用TBST(Tris-HCl缓冲盐溶液，含有0.05% Tween 20) 溶液稀释PCV2阳性血清(1∶1 000)，室温孵育1 h，洗涤后，再用HRP-羊抗猪IgG(1∶10 000)，室温再孵育1 h，洗涤后，ECL显色分析。

1.6 蛋白质表达形式分析以及蛋白质纯化

1.6.1 蛋白质表达形式的分析 收集1 ml诱导后重组菌培养物，离心收集菌泥，用1/5 体积的TE(pH为8.0)缓冲液重悬，在冰水浴中超声裂解，1次2 s，间隔2 s，直到菌体全部破碎，离心分离菌体上清液和沉淀，上清液为可溶性蛋白，沉淀为包涵体。SDS-PAGE分别电泳上清液和沉淀，分析重组蛋白是否为可溶性表达。

1.6.2 重组蛋白的纯化 参照 His·BindTMResin 亲和层析蛋白纯化步骤对菌体的上清液部分进行纯化，并对纯化蛋白进行SDS-PAGE分析。

1.7 重组Cap蛋白的免疫效力

1.7.1 疫苗的制备 测定经过纯化的重组蛋白浓度，用于疫苗制备。选取2个剂量的Cap 抗原10 μg和50 μg，与佐剂ISA 206分别进行乳化制备疫苗，添加免疫增强剂A(含有5 μg LTB和5 μg 沙门氏杆菌鞭毛蛋白)以提高免疫效果。配制疫苗和与动物分组情况见表 1。

1.7.2 免疫小鼠 参照文献[13]，将5～6周龄Balb/c雌性小鼠 60只，随机分成5组，标记为 G1～G5，每组12只，如表 1 中所示， G3组接种全病毒灭活疫苗，为南京天邦生物科技股份有限公司产品。所有疫苗皮下多点注射小鼠(试验数量为12只)。

表1动物免疫情况

Table1Theimmunizationofanimal

组别免疫增强剂抗原佐剂G1AFh8⁃CapISA206G2AFh8⁃CapISA206G3-对照苗G4(对照1)APBSISA206G5(对照2)---

G1免疫剂量为10 μg,G2免疫剂量为50 μg,G3免疫剂量为0.2 ml。

1.7.3 PCV2 特异性抗体检测 使用圆环病毒2型抗体检测试剂盒(Synbiotics公司产品)测定小鼠血清OD450值，操作步骤参照说明书进行。所有小鼠分别于免疫前(0 d)和免疫后(28 d)采血，分离血清，保存待检。

1.7.4 PCV2 强毒攻击试验[14-15]免疫后 28 d，所有小鼠腹腔注射PCV2b病毒(1 ml含 106.25TCID50)，每只0.1 ml，连续观察 21 d。PCR方法检测组织中PCV2 病毒，以分析免疫动物和非免疫动物病毒携带的差异，进而评价重组Cap疫苗的免疫效力。

2 结果与分析

2.1 重组表达质粒的鉴定

构建的重组质粒pCold-Fh8-Cap、pCold-Cap、pCold-Fh8 和pCold经XhoⅠ与EcoRⅠ双酶切，结果显示pCold-Fh8-Cap和pCold-Cap在紫外线下可见载体片段和 702 bp 左右目的条带，与预期片段相符，pCold-Fh8 和pCold只有载体片段。

2.2 重组蛋白的 SDS-PAGE

经 SDS-PAGE 电泳分析，与对照菌pCold-Fh8/BL21和pCold I/BL21相比，重组菌pCold-Fh8-Cap/BL21和pCold-Cap/BL21分别在35 000 (图 1)和27 000(图3)处明显多出1条蛋白质条带，说明重组菌pCold-Fh8-Cap/BL21和pCold-Cap/BL21在IPTG 诱导下成功获得表达，与预期结果相符。

1：pCold-Fh8/BL21 诱导前；2：pCold-Fh8/BL21 诱导后；3：重组菌 pCold-Fh8-Cap/BL21 诱导前；4：重组菌 pCold-Fh8-Cap/BL21诱导后；M：预染中分子量蛋白质标准。图1 SDS-PAGE鉴定重组菌pCold-Fh8-Cap/BL21的表达Fig.1 Identification expression of recombinant bacteria pCold-Fh8-Cap/BL21 with SDS-PAGE analysis

2.3 重组蛋白的可溶性分析

诱导后的重组菌pCold-Fh8-Cap/BL21和 pCold-Cap/BL21菌体，分别进行超声波破碎，SDS-PAGE 分析全菌裂解物、破碎后上清液以及破碎后沉淀。结果表明，重组菌 pCold-Fh8-Cap/BL21诱导表达靶蛋白大部分在上清液中，以可溶性形式存在(图 2)，而重组菌pCold-Cap/BL21目的蛋白以包涵体形式表达，存在于菌体沉淀中(图3)。

M：分子量蛋白质标准；1：重组菌 pCold-Fh8-Cap/BL21超声破碎全菌蛋白质；2：重组菌 pCold-Fh8-Cap/BL21超声破碎上清液； 3：重组菌 pCold-Fh8-Cap/BL21超声破碎沉淀。图2 重组蛋白fh8-Cap的可溶性分析Fig.2 The solubility of the recombinant protein fh8-Cap

M：蛋白质分子量标准；1：重组菌 pCold-Cap/BL21超声破碎全菌蛋白质；2：重组菌 pCold-Cap/BL21超声破碎上清液；3：重组菌 pCold-Cap/BL21超声破碎沉淀。图3 SDS-PAGE鉴定重组菌pCold-Cap/BL21的表达和可溶性分析Fig.3 Expression identification of recombinant bacteria pCold-Cap/BL21 with SDS-PAGE and the solubility of the recombinant protein

2.4 蛋白质纯化和Western blotting鉴定

2.4.1 蛋白质纯化 重组菌pCold-Fh8-Cap/BL21超声裂解的菌体上清液经His·BindTMResin 亲和层析柱纯化，获得高纯度可溶性重组蛋白，分子量为35 000(图4)，洗脱蛋白质的第3管浓度明显高于第1管和第2管。

2.4.2 Western blotting鉴定 对照菌pCold-Fh8/BL21和重组菌pCold-Fh8-Cap/BL21全菌裂解物，经 SDS-PAGE电泳后转膜，Western blotting 鉴定，在目的条带大小(35 000)位置出现1条明显的黑色印迹，而对照菌的泳道在相应位置则无反应条带(图5)，这说明表达产物可被猪PCV2 多克隆抗体特异性识别，具有较好的反应原性。

1～3：重组Cap蛋白第1～3管；M：预染中分子量蛋白质标准。图4 SDS-PAGE分析纯化的重组蛋白Fig.4 The SDS-PAGE analysis of purified recombinant protein

1：重组菌 pColdⅠ-Fh8-Cap/BL21诱导后；2：pColdⅠ-Fh8/BL21 诱导后；M：预染中分子量蛋白质分子量标准。图5 Western blotting 鉴定重组蛋白Fig.5 Identification of the recombinant protein with Western blotting assay

2.5 免疫小鼠的免疫效力

2.5.1 血清PCV2特异性IgG抗体检测 连同对照小鼠，使用试剂盒检测各免疫小鼠的PCV2抗体水平，由图6可见，免疫小鼠血清OD450均值极显著(P<0.01)高于所有对照小鼠，免疫组G1(OD450=1.15)、G2(OD450=1.24)和G3(OD450=1.22)各组间平均OD450差异不显著(P>0.05)。对照组G4(OD450=0.13)和G5(OD450=0.14)血清均值低于试剂盒的质控阴性对照(OD450=0.30)。结果表明，可溶性表达的Cap蛋白具有良好的免疫原性。

OD450≥0.5 判为阳性。G1、G2、G3、G4、G5分别表示Cap疫苗10 μg组、Cap疫苗50 μg组、商品化疫苗组、单独佐剂组和未接种组。图6 PCV2抗体检测结果Fig.6 Detection of PCV2 specific antibody

2.5.2 攻毒小鼠的PCR检测 除G5外，所有小鼠均攻毒。于攻毒后21 d内，每周剖杀3只，取肺脏和肝脏进行检测，结果显示，G4小鼠，可以扩增出目的条带，702 bp，而G5小鼠PCR检测为阴性，说明小鼠作为PCV2攻毒模型成立。免疫组中(G1、G2和G3)，攻毒后7 d和14 d，PCR结果为阳性，第21 d，免疫组(G1、G2和G3)全部为阴性。结果表明，可溶性的重组Cap蛋白疫苗免疫后，有效阻止了PCV2在动物体内的复制(表2)。

表2小鼠脏器PCR检测结果

Table2PCRdetectionfororgansfromthemice

监测期(d)G1G2G3G4G573/33/33/32/30/3143/32/33/33/30/3210/30/30/33/30/3

表中数据表示阳性数/总数。

3 讨 论

PCV2作为严重影响国内外养猪业发展的重要病原之一，它引起的PMWS 在世界范围内广泛流行[1]。该病毒主要侵害猪的免疫系统，并能够造成机体的免疫抑制，给国内外养猪业造成不可估量的经济损失。

Cap蛋白作为病毒唯一的结构蛋白，常被用于PCV2疫苗和诊断方法的研究[6]。昆虫细胞/杆状病毒表达系统生产的亚单位疫苗，已被广泛使用。假型杆状病毒载体疫苗、乳酸菌口服活载体疫苗、博德特氏菌载体疫苗和大肠杆菌载体疫苗正在研制中。其中大肠杆菌表达载体作为非常成熟的表达载体，拥有便于培养、生长速度快等特点，但病毒蛋白多为包涵体表达，将在一定程度上影响抗原的免疫原性等生物学特性，进而影响其广泛应用。

Fh8肽段是肝片吸虫感染早期分泌的蛋白质，具有成为可溶性表达增强子的先天优势[11-12]。本研究构建PCV2ORF2 和Fh8-ORF2融合基因，克隆到低温表达质粒中，均获成功表达，但只有Fh8-Cap为可溶性蛋白，解决了Cap的体外表达难题。

以小鼠为模型，评估Fh8-Cap蛋白的免疫原性[13-15]。重组蛋白免疫小鼠1次，第4周可诱导较高水平的IgG，OD450值可达1.0以上。不管低剂量(每只10 μg)还是较高剂量(每只50 μg)，均可诱导较高滴度抗体，并且剂量之间无显著差异，进一步表明Fh8-Cap具有良好的免疫原性，为研制新型亚单位疫苗和检测诊断技术奠定物质基础。

综上所述，本研究成功表达PCV2型Cap蛋白，借助Fh8融合标签，获得可溶性蛋白。相比对照小鼠，免疫小鼠产生高滴度抗体，并且脏器病毒载量明显降低。

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