拮抗植物病原真菌Streptomyces corchorusii AUH-1的分离与鉴定

章帅文，杨 勇，刘 群，吴志明，李昆太

（江西农业大学生物科学与工程学院/江西省农业微生物资源开发与利用工程实验室，江西 南昌 330045）

植物病害是造成农作物生长受阻、产量下降和品质降低的主要原因之一。据统计，全球每年因植物病害而造成的农业产量下降比例就高达10%～16%［1］。植物病原菌主要包括细菌、病毒、真菌、线虫等，而约3/4的植物病害是由植物病原真菌引起的［2］。植物病原真菌常借助侵染垫、附着胞和吸器等侵染结构完成对寄主的侵染，并在寄主组织中大量生长，从而诱发植物真菌病害的发生［3-4］。例如，由稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）和水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）引发的水稻稻瘟病以及纹枯病，已成为全球性的水稻主要病害［5-6］；尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）是一种最为常见的世界性的土传病原真菌，可引起葫芦科、香蕉、瓜类、豆科、茄类、棉花等100多种植物发生枯萎病［7-9］；此外，由炭疽病菌（Colletotrichum）引发的植物炭疽病，也是造成花果和蔬菜等植物重大损失的一类常见真菌病害［10］。

利用拮抗微生物或其代谢产物进行植物病害生防，具有环保、安全、无残留等优点，且不易使病原菌产生抗药性，而且很多拮抗微生物都具有对作物的促生作用，因此微生物生防显示出越来越广阔的应用前景，成为目前研究开发的热点。

黄麻链霉菌（Streptomyces corchorusii）是链霉菌属中的一种，对黄瓜枯萎病［11］、草莓枯萎病［12］、草莓炭疽病［13］等多种植物病害均具有一定的抑制作用。本研究以西瓜枯萎病菌为指示菌，从土壤中分离筛选到1株对植物病原真菌具有良好拮抗作用的黄麻链霉菌AUH-1，采用生理生化方法和16S rDNA序列分析对其鉴定，以期为该拮抗菌后期的活性物质检测与生物防治应用提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试土样：从江西南昌、赣州、鹰潭、萍乡、福建武夷山、河北石家庄等地用五点取样法采集不同类型土样26个。

供试菌株：意大利青霉（Penicillium italicum）、西瓜枯萎病菌（Fusarrium oxysporum f.sp.niveum）、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），均由本实验室保藏。

培养基：高氏一号培养基，PDA培养基，硫化氢（H2S）产生培养基（柴斯钠培养基），纤维素分解培养基，明胶液化培养基，淀粉水解测定培养基，牛奶液化测定培养基，硝酸盐还原培养基［14-15］。

主要试剂：Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒，Taq DNA聚合酶；DNA marker，PCR通用引物等。

主要仪器：2720 Thermal cycler PCR仪，3730-XL测序仪，FR980凝胶成像系统，HC-2518R 冷冻高速离心机，DYY-5电泳仪，光学显微镜，超净工作台，恒温培养箱等。

1.2 试验方法

1.2.1 拮抗放线菌菌株的分离筛选 放线菌菌株的分离：为了获得丰富的放线菌资源，本研究从江西南昌、赣州、鹰潭、萍乡、武夷、河北等地采集了26个不同类型的土样。分别称取10 g土样加入装有90 mL无菌水的三角瓶中制成10-1的土壤悬浮液，以无菌水梯度稀释至10-3、10-4、10-5；吸取0.2 mL各梯度稀释液，分别涂布在加有50 mg/L放线菌酮和50 mg/L重铬酸钾的高氏一号培养基平板上，30℃培养7 d；挑取呈放线菌菌落特征的单菌落，转接于高氏一号培养基进一步分离纯化和保存。

放线菌菌株纯化：挑取30℃培养7 d后呈放线菌菌落特征的单菌落，转接到高氏一号培养基中进一步分离纯化，于20%甘油溶液中保存，-20℃存放备用。

采用平板对峙培养法进行拮抗菌的初筛［16］：将待测病原真菌菌饼菌（6 mm）面朝下接种至中心位置，用灭菌后的牙签挑取相同大小的供试放线菌倒置接种于距中心30 mm处，每个处理3次重复，以只接植物病原真菌作为对照，28℃恒温培养，待对照组植物病原真菌菌丝铺满整个平板时，测定实验组的抑菌带宽度（R2）和指示菌菌落直径（R1），并根据（R1-R2）/R1的比值大小，筛选出抑菌活性强的放线菌菌株。

拮抗放线菌的复筛：采用管碟法（牛津杯）进行拮抗放线菌的复筛。将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌悬液与冷却至50℃的牛肉膏蛋白胨培养基混合均匀，每100 mL培养基加入10 mL菌悬液，制成带菌平板。类似地，酿酒酵母菌、西瓜枯萎病菌、枯草芽孢杆菌等以PDA培养基制成带菌平板。等平板凝固后，在平板上放经过灭菌的牛津杯，各取200 mL经复筛培养基（可溶性淀粉20.0 g/L，KNO31.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，MgSO40.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，pH 7.2～7.4）发酵的无菌发酵液吸入其中。细菌在37℃培养2 d，真菌在30℃培养2～3 d。然后测定抑菌圈直径，挑选出具广谱抗菌特性的拮抗放线菌。

1.2.2 拮抗菌株的鉴定 菌丝形态学观察：采用平皿插片法，将拮抗菌株接种于高氏一号固体培养基上，28℃培养7～14 d，取插片在光学显微镜下观察基内菌丝和气生菌丝的形态。

生理生化特征：参照《链霉菌鉴定手册》［15］中的方法，进行拮抗菌的碳源利用、明胶液化、纤维素分解、淀粉水解、牛奶凝固与胨化、硝酸盐还原、产H2S测定等试验。

分子生物学鉴定：使用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取拮抗菌株的基因组DNA，采用通用引物27F（5′-AGTTTGATCMT GGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTG TTACGACTT-3′）进行PCR扩增拮抗菌株的16SrDNA。PCR反应条件为：94℃预变性4 min；94℃变性 45 s、55℃退火 45 s、72℃延伸 1 min，30个循环；最后72℃延伸10 min。待PCR反应完成后，取1μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，确认PCR扩增片段。将测序得到的16SrDNA序列在NCBI网站进行BLAST比对，用MEGA 4.1软件以Neighbor-Joining法构建系统发育树，确定拮抗菌株的亲缘关系和分类地位。

采用Excel 2003和DPS 7.5软件进行数据统计和分析，采用Photoshop CS5进行图像处理。

2 结果与分析

2.1 拮抗放线菌的分离筛选

2.1.1 拮抗放线菌的初筛 以西瓜枯萎病病原菌为供试菌株，采用对峙法对26个不同类型的土样中初筛得到15株对西瓜枯萎病菌具有较强拮抗作用的菌株，结果见表1。其中，由抑菌带的大小和（R1-R2）/R1的比值大小可知，菌株AUH-1对西瓜枯萎病菌的抑制能力最强，其抑菌带宽度和（R1-R2）/R1比值分别达到29.46（±0.48）mm和36.15%，如图1（封三）所示。

表1 拮抗放线菌的初筛结果

2.1.2 拮抗放线菌的复筛 采用管碟法测定拮抗菌株AUH-1对不同供试菌株的抑制效果，挖取2 cm×1 cm大小的菌块接种至装量为40 mL/250 mL三角瓶的液体发酵培养基（蔗糖30 g/L，玉米淀粉20 g/L，玉米浆20 g/L，黄豆饼粉 10 g/L，(NH4)SO41 g/L，KH2PO40.25 g/L，MnCl20.05 g/L，MgSO41 g/L，NaCl 0.5 g/L，pH 7.2～7.4）中发酵，180 r/min、28℃下摇床培养96 h，发酵液无菌过滤，备用。将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌悬液与冷却至50℃的牛肉膏蛋白胨培养基混合均匀，每100 mL培养基加入10 mL菌悬液，制成带菌平板。类似地，酵母菌、枯草芽孢杆菌、西瓜枯萎病菌、意大利青霉菌和水稻纹枯病菌等以PDA培养基制成带菌平板。平板凝固后，在平板上放置经过灭菌的牛津杯，各取200 μL无菌发酵液吸入其中。细菌在37℃培养2 d，真菌在30℃培养2～3 d。然后用十字交叉法测抑菌圈直径。结果见表2。

2.2 菌株AUH-1的鉴定

2.2.1 菌株AUH-1的菌落特征 从图2（封三）可以看出，菌株AUH-1的菌落正常、黄色、几乎不产孢子，长于基内，具有明显的放线菌菌落特征。为了进一步鉴定该菌株的种属情况，对其开展了菌体形态学观察、生理生化特征以及16S rDNA序列分析。

表2 菌株AUH-1发酵液对供试菌株的抑制效果

2.2.2 菌株AUH-1的菌丝形态特征 菌株AUH-1在PDA培养基上培养7 d后，在光学显微镜下观察到的菌丝体形态如图3（封三）所示。菌株AUH-1在PDA培养基上生长发育良好，基内菌丝和气生菌丝较为丰富，少量气生菌丝分化形成孢子。

2.2.3 菌株AUH-1的生理生化特征 表3为菌株AUH-1的碳源利用情况和生理生化特征。从表3可以看出，菌株AUH-1可以利用D-葡萄糖、D-甘露醇、蔗糖、麦芽糖、肌醇、D-果糖、和淀粉，不能利用D-木糖、山梨醇、甘油和阿拉伯糖；菌株AUH-1不能水解淀粉和分解纤维素，能使明胶液化以及牛奶凝固与胨化，能产硫化氢和还原硝酸盐。

表3 菌株AUH-1的生理生化特征

2.2.4 菌株AUH-1的分子生物学鉴定 菌株AUH-1的基因组DNA经PCR扩增后得到1条约为1.4 kb的特征带，经测序其16S rDNA的序列长度为1 491 bp。将该序列与NCBI数据库中相应的16S rDNA序列进行Blast比对，采用Neighbor-Joining方法构建菌株AUH-1的系统发育树（图4），分析结果显示菌株AUH-1与Streptomyces corchorusii的系列同源性达到99%。

3 结论与讨论

微生物防治主要是利用有益的微生物，通过生物碱间的竞争、抗生、寄生、溶菌及诱导抗性等作用，抑制病原物的存活［17］。目前，用于植物病害生防的微生物种类繁多，主要有真菌、细菌和放线菌等［18］。例如，作为植物根际促生菌中最大的细菌种群，假单胞杆菌（Pseudomonas spp.），尤其是荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorscens），能有效地定殖在植物根际，控制植物病害、促进植物生长，是植物病害生防研究中的一个重要类群［19］。

图4 基于16S rDNA序列构建的AUH-1菌株系统发育树

放线菌是一类广泛存在于土壤、植物体、淡水和海洋中的生防菌［20］，种类繁多，具有复杂的次级代谢系统，能产生诸多结构新颖、生物活性显著的次级代谢产物，是微生物农药的重要来源［21］，在植物病害防治中具有举足轻重的作用［22］。目前从自然界中发现上万种天然抗生素中，近70%是由放线菌产生的，其中链霉菌产生的抗生素占总数的52%［23-25］。链霉菌是放线菌门中种类最多的一个属，是各种抗生素的主要产生来源［26-27］。链霉菌产生的抗生素类物质，能够特异作用于某些病原菌，降低其生长和繁殖速度，从而降低病害发作的频率［28］。其中，由链霉菌产生的灭瘟素（Blasticidin S）、春日霉素（Kasugamycin）、多氧霉素（Polyoxins）、井冈霉素（Validamycin A）等，更是成功地商业化运用于水稻、蔬菜和果类等的真菌病害防治中［29］。

本研究通过分离筛选得到1株拮抗链霉菌AUH-1，初步鉴定为黄麻链霉菌（Streptomyces corchorusii）。黄麻链霉菌作为链霉菌属的一员，然目前国内外对该菌的报道极少，特别是对其所产活性物质结构及抑菌机理等方面的研究更是少之甚少。燕照玲等［11］在开展植物病原真菌拮抗菌的分离筛选过程中，也获得了1株对黄瓜枯萎病菌具有高效拮抗作用的Streptomyces corchorusii，但未有关于其活性物质方面的研究。根据国外现有研究表明，Streptomyces corchorusii系蒽醌类（anthraquinone）抗肿瘤抗生素的主要产生菌［30］，如拒霉素（resistomycin）和特曲霉素D（tetracenomycin D）［31］。值得注意的是，本研究是以植物病害生物防治为目的，分离筛选到1株植物病原真菌拮抗菌Streptomyces corchorusii AUH-1，该菌是否也会产生拒霉素和特曲霉素D等抗肿瘤抗生素，有待进一步对其活性组分进行结构鉴定。另外，尽管菌株AUH-1具备的广谱性拮抗植物病原真菌特点为其在不同类型植物病害上的生防应用奠定了基础，但其抑菌机理以及在田间的防病效果，有待进一步研究。

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