一株小叶榕抗菌内生细菌的分离、筛选和鉴定

邓雪萍，杨 博

（1.清远职业技术学院食品药品学院，广东 清远 511510；2.华南理工大学生物科学与工程学院，广东 广州 510006）

在健康植物组织内部通常生存着一些微生物，但不会导致宿主植物有明显的感染症状，称为植物内生菌［1］。有研究报道，植物的根、茎、叶、花、果实和种子经过表面消毒后，均能分离到内生菌。植物内生菌能产生种类多样的活性成分，经证实，这些活性成分大多为抗肿瘤活性类［2-3］、抗菌类活性类［4-5］、抗糖尿病物质类［2］、活性酶类［6-7］、抗氧化活性类［8］、杀虫活性类［9-10］、促植物生长类［11］等。因此，内生菌在生物防治、医药卫生等领域的应用潜力非常大，国内外对内生菌的相关研究也越来越多［10］。

小叶榕（Ficus microcarpa L.f.）是常绿小乔木，树冠伞形或圆形，叶色深绿，入药主要用其叶。小叶榕的叶片含有多种药用成份，如黄酮、三萜类、齐墩果酸、脂肪族化合物和甾体化合物等，经证实，小叶榕水提取物和醇提取物有止咳平喘作用，对治疗心血管疾病、抗炎、抑菌等方面都有显著效果［12］。目前，还没查询到国内外对小叶榕内生菌的相关研究资料。本试验从清远职业技术学院校内种植的小叶榕中分离纯化内生菌，并筛选抗菌活性菌株，鉴定到菌种，为寻找天然抗菌物质提供有用资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

植物样本：选取清远职业技术学院校内种植的小叶榕的不同植株，采集健康的茎和叶片。

培养基：营养琼脂（NA），营养肉汤（NB），高氏一号培养基，马铃薯葡萄糖（PDA）培养基，发酵培养基（1%葡萄糖、2%酵母粉、0.3% 磷酸氢二钾、0.05%氯化钠，pH 7.0）。

筛选指示菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、大肠埃希菌（Escherichia coli）、白色念珠菌（Candida albicans）、黑曲霉（Aspergillus niger），均由清远职业技术学院应用微生物研究所提供。

1.2 试验方法

1.2.1 小叶榕内生菌的分离纯化 用无菌剪刀剪取植株顶端健康的茎段和嫩叶，用干净的保鲜袋装好，立即进行下述处理（如不能立即处理，则将样本置于4℃冰箱中1周内处理）：茎段和叶片均采用75%酒精-0.1%升汞法表面消毒，印迹法和最终洗涤水法相结合检验消毒效果。分离内生菌时，茎段采用组织块法，叶片采用组织匀浆法［13］，具体操作见图1～图3，所有操作均为无菌操作。对照平板7 d内有菌生长或分离平板在7 d内无菌生长，均判定表面消毒无效；对照平板7 d内无菌生长且分离平板在7 d内有菌生长，则判定表面消毒有效。逐日观察对照平板和分离平板，一旦发现培养基中有菌长出，及时分离纯化到对应培养基，28（±1）℃（内生真菌）或36（±1）℃（内生细菌）培养3～7 d。重复以上步骤，直至分离到纯培养物。

图1 茎段内生菌分离步骤

图2 叶片内生菌分离步骤

图3 对照平板制备流程

1.2.2 抗菌活性内生菌的筛选 发酵滤液的制备：内生菌解冻复苏后，取5环到5 mL无菌生理盐水制备菌悬液，按1%的接种量接入发酵培养基，在34（±1）℃、160 r/min摇床中培养72 h。发酵液8 000 r/min离心10 min，上清液用0.45 μm的无菌微孔滤膜过滤除菌后得发酵滤液，用作抑菌试验［13-15］，3次重复（本试验只对分离得到的两株内生细菌进行抗菌活性筛选）。

杯碟法检测发酵滤液抗细菌、抗酵母菌活性：将指示菌金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌接种于NA平板，36（±1）℃培养24 h；白色念珠菌接种于PDA平板，28（±1）℃培养48 h。选取单菌落混悬于灭菌生理盐水，使指示菌液最终浊度与0.5号麦氏标准比浊管相同，此时菌悬液中菌数大概为1.5×108CFU/mL［13，16］。在平板上均匀涂布指示菌液，5 min后用无菌镊子夹取无菌牛津杯放入平板上，每块平板可放3～4个牛津杯，牛津杯之间的距离相等。牛津杯内加入200 μL发酵滤液，盖上皿盖，用无菌生理盐水做对照。以上均在28（±1）℃暗处培养48 h，培养完毕，取出牛津杯，测量抑菌圈直径。

菌落生长速率法检测发酵滤液抗丝状真菌活性：黑曲霉为指示菌，将1 mL发酵滤液加入到无菌培养皿中，倒入9 mL已冷却至40℃左右的PDA培养基，充分摇匀，冷却后，将直径6 mm、28（±1）℃培养48 h的黑曲霉菌块接种于该平板中央，盖上皿盖，以不加发酵滤液的10 mL PDA培养基作为对照，试验平板和对照平板均在28（±1）℃暗处培养3～5 d，每天用游标卡尺测量菌落直径，计算内生菌发酵滤液对黑曲霉菌丝生长的抑制率（%）［17-18］。

1.2.3 抗菌活性内生菌的鉴定 培养特征、菌体形态观察及生理生化特性试验：本试验仅对分离得到的抗菌活性内生细菌QYPT-B01进行鉴定。将内生菌株接种到NA斜面、NA平板、NB肉汤，34（±1）℃培养2～5 d，观察内生菌的培养特征，并进行革兰氏染色、芽孢染色和生化反应，按《常见细菌系统鉴定手册》［19］中的方法进行操作和鉴定：抑菌圈直径0～5 mm 表示无抑制作用，6～15 mm 表示弱抑制作用，＞15 mm 表示强抑制作用。

16S rDNA基因序列测定：将内生细菌菌株接种到营养肉汤，34（±1）℃下160 r/min培养至对数生长期后，12 000 r/min离心5 min，在菌体沉淀中加入50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）800 μL和32 μL溶菌酶，使溶菌酶最终浓度为2～4 mg/mL，振荡均匀；37（±1）℃保温30～60 min至菌液呈牛乳状；加入65 μL 25%SDS，颠倒混匀，50～60℃水浴10 min至溶液完全清亮；加入200～400 μL氯仿-异戊醇（24∶1）溶液，充分振荡混匀，冰上放置10 min；12 000 r/min条件下离心10 min后，取上清液；加入0.7～1倍体积异丙醇，颠倒混匀，将白色絮状沉淀挑出至70%乙醇中洗涤两次，吹干，溶于适量的超纯水中，振荡溶解，置于－20℃冰箱中。按上述方法提取基因组DNA后，以其为模板，设计引物为 P16sF1：5′-AGAGTTTGATCCTGGC TCAGAACGAACGCT-3′；P16sB1：5′-TACGG CTACCTTGTTACGACTCACCCC-3′。PCR 的程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s；48℃退火30 s；72℃延伸1.5 min；30个循环后72℃延伸10 min，4℃保温。PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，切割目标条带，使用Roche Applied Science试剂盒纯化电泳产物。PCR反应扩增出的16S rDNA片段经纯化后，委托上海生工生物工程技术服务公司测序。利用NCBI网站中的Blast工具（ http：//www.ncbi.nlm.nih.gov），将QYPT-B01菌株的16S rDNA序列与Genbank中已知细菌的16S rDNA序列进行比较，寻找与目的基因序列同源性最高的己知分类地位的菌种，并得到同源性相似百分比。Matsulci［20］研究认为，凡是16S rDNA可变区序列同源性大于97.5%便可认为是同一个种，所以本试验以同源性大于97.5%为菌种的鉴定标准，进一步利用MGTA7.0.26软件构建系统发育树，确定该菌的分类地位。

2 结果与分析

2.1 小叶榕内生菌分离纯化结果

从小叶榕植物样本中分离得到7株丝状真菌和2株细菌。将分离得到的9株内生菌进行体外培养，发现有一株丝状真菌不能生长（表1）。

表1 小叶榕内生菌的分离纯化结果

2.2 抗菌活性内生菌筛选结果

分离得到的一株小叶榕内生细菌（命名为QYPT-B01）发酵滤液对革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌和大肠埃希菌有较强的抑制作用（图4，封三；表2），其中对铜绿假单胞菌的抑菌圈直径达23.28（±0.286）mm，对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌有较弱的抑制作用，而对枯草芽孢杆菌没有抑制作用。QYPT-B01菌株发酵滤液对白色念珠菌没有抑制作用，对黑曲霉的生长有很强的抑制作用（图5，封三；表3），培养3 d后该菌株发酵滤液对黑曲霉菌丝生长的抑制率达77.25（±0.212）%，培养5 d后抑菌率达82.39（±0.140）%。在培养过程中，对照平板黑曲霉菌落厚、菌丝多且强壮、形成大量黑色孢子，而试验平板菌落薄、菌丝少且纤细、没有孢子形成，培养4 d后菌落大小不再有变化。试验分离到的另一株内生细菌对5种指示菌均无抑制作用。

表2 QYPT-B01菌株发酵滤液对4种指示菌的抑菌效果

表3 QYPT-B01菌株发酵滤液对黑曲霉菌丝生长的抑制效果

2.3 抗菌活性内生菌鉴定结果

2.3.1 培养特征、菌体形态观察及生理生化特性试验结果 QYPT-B01菌株在34（±1）℃培养箱中培养3 d后，在NA斜面上其菌苔呈灰白色，边缘不规则，向四周扩展，表面有皱褶、干燥、不透明；在NA平板上其菌落灰白色，较大，扁平，边缘不规则，菌落向四周扩展明显，呈树根状，表面有皱褶、干燥、不透明；在NB肉汤液面形成一层灰白色的菌膜，培养液仍澄清。革兰氏染色呈阳性，显微镜下观察呈直杆状，芽孢近中生，孢子囊不膨大。菌株的主要生理生化特征见表4。结合培养特征、形态观察和生理生化特性，初步鉴定QYPT-B01菌株为芽孢杆菌属。

2.3.2 16S rDNA测序结果 QYPT0-B1菌株的16S rDNA经PCR扩增，用1%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物分析，结果见图6。从图6可以看出，QYPT-B01菌株的16S rDNA扩增片断长约1.5 kb，细菌16S rDNA的长度一般为1.550（±0.200）kp。将PCR产物测序，得到全长为1.426 kp的16S rDNA序列。该序列与GenBank中的细菌16S rDNA序列比较，获得同源序列为芽孢杆菌属（Bacillus）的16S rDNA序列，其相似性达到98%。QYPT-B01菌株的16S rDNA序列与66株枯草芽孢杆菌16S rDNA序列的相似性也达98%（表5）。基于QYPT-B01菌株和芽孢杆菌属的10个模式菌株的16S rDNA序列，利用MEGA7.0.26 软件中的Neighbor-Joining方法构建系统发育树，1 000次随机抽样，计算自引导值（Bootstrap）以评估系统进化树的置信度。从建立的系统发育树（图7）可以看出，QYPTB01和枯草芽孢杆菌的进化距离最靠近。结合培养特征、形态观察和生理生化特性，最终鉴定内生细菌QYPT-B01为枯草芽孢杆菌。

表4 内生细菌QYPT-B01菌株与枯草芽孢杆菌主要生理生化特征比较

图6 QYPT-B01菌株16S rDNA的PCR扩增结果

3 结论与讨论

从小叶榕植物样本中分离得到7株丝状真菌和2株细菌，将分离得到的9株内生菌进行体外培养，发现有一株丝状真菌不能生长。可能是由于某些内生菌的生长需要依赖宿主植物提供的环境条件，所以在普通培养基上难以生长，需进一步研究适合其生长的植物体外培养条件。

对分离得到的两株内生细菌进行初筛，发现QYPT-B01菌株发酵培养72 h，其发酵滤液对铜绿假单胞菌和大肠埃希菌有较强的抑制作用，抑菌试验平板培养48 h，对铜绿假单胞菌的抑菌圈直径达23.28（±0.286）mm，对金黄色葡萄球菌的抑制作用较弱。QYPT-B01菌株发酵滤液对黑曲霉菌丝的生长有很强的抑制作用，试验平板培养5 d后抑菌率达82.39（±0.140）%。综上所述，小叶榕QYPT-B01菌株能产生主要针对革兰氏阴性菌和丝状真菌的抗菌活性物质，具有潜在的应用价值。对抗菌能力较强的内生细菌QYPT-B01菌株进行了培养特征和菌体形态观察、生理生化特性试验、16S rDNA基因序列测定和系统发育树的构建，最终鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

表5 QYPT-B01菌株与6株枯草芽孢杆菌的16S rRNA基因同源性比较

图7 QYPT-B01菌株在Bacillus属中的系统发育地位

小叶榕由于易生长，遮阴效果好，所以分布十分广泛，也是街道、公园、绿地、公路、企事业单位常用的园林景观植物。但是受气候、栽培因素等影响，小叶榕极易发生病虫害，如槐尺蛾、刺蛾、灰白蚕蛾、榕木虱、榕管蓟马、叶斑病、煤污病、炭疽病等［21］。传统的治疗方法有合理密植、科学修剪、化学药剂喷注和生物防治等方法，目前主要是用化学药剂喷雾法［22］。从保护生态环境和可持续发展的角度看，生物防治是最好的防治方法，对人、畜、植物均安全，主要包括保护有益天敌和使用生物农药两种措施。小叶榕内生菌QYPT-B01是枯草芽孢杆菌，具有防治植物病害的作用，国内外已经成功研制出一批枯草芽孢杆菌菌剂［23-24］。国内已开发并投入生产的枯草芽孢杆菌商品制剂有麦丰宁、百抗、纹曲宁、依天得、亚宝等。QYPT-B01内生菌能产生抑菌活性物质，今后可进一步研究该活性代谢产物对植物病原菌的拮抗作用，以开发具生防作用的微生物菌剂。植物与动物和人类一样，均属于真核系统，而内生菌能寄生在植物体内，说明内生菌产生的活性物质毒性较低或无毒，否则宿主组织会受损伤甚至死亡，可见，植物本身已对活性成分进行了初筛，利用QYPT-B01内生菌作为生防菌剂的来源优势明显，具有良好的应用前景。

综上可知，今后可进一步研究QYPT-B01菌株发酵液中活性物质的组分及其对植物病原菌的拮抗作用，以进一步开发生物防治菌剂。

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