蛴螬抗菌肽的制备及其稳定性研究

王 成，余以刚，张 青，余祥雄，梁泽明

（华南理工大学食品科学与工程学院，广东 广州 510641）

近年来，由于滥用抗生素饲料添加剂导致的抗药性和药物残留问题已经严重影响到人类健康，寻找一类新型的抗菌药物是解决该问题的有效途径。昆虫抗菌肽是昆虫免疫后血淋巴中的一类抗菌多肽，它具有分子量小、热稳定性好、抗菌谱广的特点，可以抑杀某些真菌、病毒及原虫，且抗菌机理独特，不易产生抗药性［1］。研究表明，抗菌肽具有作为一类新药开发的巨大潜力，但由于抗菌肽的蛋白性质，很多种类的抗菌肽稳定性特别是酶解稳定性差，制备出稳定性好的抗菌肽具有重要的实际意义。

抗菌肽又称抗微生物肽，是生物体液免疫的重要防御因子，在昆虫的先天性免疫系统中发挥重要作用，抗菌肽主要由脂肪体（类似于哺乳动物的肝脏）分泌，其他组织如消化道、气管、马氏管和特定的血细胞也能够产生［2］。当昆虫体壁受到损伤或被微生物感染后，抗菌肽被迅速合成，并释放入血淋巴中作用于细菌、病毒、真菌等［3］。其活性维持时间因昆虫种类不同存在明显差异［4］。

蛴螬隶属于鞘翅目（Coleoptera），是金龟甲总科（Scarabaeoedea）幼虫的统称，又名地蚕、土蚕［5］。借助现代的医学以及检测手段分析得知，蛴螬体内含有各种氨基酸、多肽或蛋白质、糖类、生物碱和羧酸类化合物，以及较高含量的钙、铁、铜、锰等矿物元素［6］。近年来的研究表明，蛴螬具有显著的抗癌抑癌、抗肿瘤［7］、抗氧化［8］、抗衰老和抗病毒、抗菌功效［9］。本研究使用酶解法以加酶量、酶解时间、料液比、pH为因素优化胰蛋白酶酶解蛴螬蛋白制备蛴螬抗菌肽的制备工艺，并研究pH、温度、盐浓度等环境因素对蛴螬抗菌肽抗菌效果的影响，为蛴螬资源的深度加工利用和自然抗菌产物研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、角蛋白酶（诺维信公司），脱脂蛴螬（广东汉肽生物工程有限公司），大肠杆菌、金黄色葡萄球菌（广州市菌种保藏中心）。

模拟胃液的配制：取胃蛋白酶3.20 g，NaCl 2.00 g，溶解于1.00 L蒸馏水中，HCl调节pH值至1.20。

模拟肠液的配制：取胰蛋白酶10.00 g，磷酸二氢钾6.80 g，溶解于1.00 L蒸馏水中，用NaOH调节pH值至7.50。

1.2 试验方法

1.2.1 碱溶酸提法提取蛴螬蛋白 准确称取50.00 g脱脂蛴螬样品，以1∶15（ g/mL）的比例加入750 mL 1.5%的NaOH溶液，于60℃恒温水浴锅中搅拌1 h，1 000 r/min下离心10 min，取上清液。往上清液中缓慢倒入8.00 mol/L的HCl，直至不再产生沉淀，1 000 r/min离心力下离心10 min，取沉淀，冷冻干燥待用［10］。

1.2.2 酶解法制备蛴螬抗菌肽 准确称取5.00 g蛴螬蛋白样品，按1∶15（ g/mL）比例加入75.00 mL蒸馏水，用0.20 mol/L NaOH和0.20 mol/L HCl将样品调整到最适pH，按照50.00 ku/g酶活加入蛋白酶，酶解过程中用0.20 mol/L NaOH和0.20 mol/L HCl维持pH。酶解完成后，95℃中水浴15 min，终止酶解反应，5 000 r/min离心5 min，取上清液，得到蛴螬酶解液。

1.2.3 牛津杯法测抑菌活性 以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌，采用牛津杯法测定蛴螬酶解样品抑菌活性［11］。使用LA复活菌株，LB培养，增值菌株。测定时，使用生理盐水调整菌液浓度至1.00×106CFU/mL。牛津杯直径为6.00 mm，上样量为150 μL。抑菌圈直径越大，抑菌效果越好［12］。

1.2.4 水解度的测定 实验中水解度的测定按照 pH-stat法测定［13］。

1.2.5 单因素实验 以抑菌效果（抑菌圈直径）为指标，在酶解温度（37℃）恒定的条件下，研究以下4个因素对抗菌肽抑菌效果的影响，实验重复3次。

加酶量的选择：准确称取5份脱脂疥虫样品各1.00 g置于50 mL锥形瓶中，以加酶量为20.00、40.00、60.00、80.00、100.00 ku/g添加胰蛋白酶，酶解时间为60 min，料液比为1∶20（g/mL），pH为8.00的条件下进行酶解，酶解过程中用0.10 mol/L的NaOH使pH恒定，记录NaOH使用量，以抑菌圈直径为指标，选择最佳酶用量。

酶解时间的选择：准确称取5份脱脂疥虫样品各1.00 g置于50 mL锥形瓶中，以加酶量为40.00 ku/g，料液比为1∶20（ g/mL），pH为8的条件下进行酶解，酶解时间分别为30、60、90、120、150 min。酶解过程中用0.10 mol/L的NaOH使pH恒定，记录NaOH使用量，以抑菌圈直径为指标，选择最佳酶解时间。

料液比的选择：准确称取5份脱脂疥虫样品各1.00 g置于50 mL锥形瓶中，以加酶量为40.00 ku/g，料液比分别为 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（ g/mL），酶解时间为90 min，pH为8的条件下进行酶解，酶解过程中用0.10 mol/L的NaOH使pH恒定，记录NaOH使用量，以抑菌圈直径为指标，选择最佳料液比。

pH的选择：准确称取4份脱脂疥虫样品各1.00 g置于50 mL锥形瓶中，以加酶量为40.00 ku/g，酶解时间为90 min，料液比为1∶20（ g/mL），pH分别为6.50、7.00、7.50、8.00、8.50的条件下进行酶解，酶解过程中用0.10 mol/L的NaOH使pH恒定，记录NaOH使用量，以抑菌圈直径为指标，选择最佳酶解pH。

1.2.6 正交法优化胰蛋白酶制备抗菌肽条件 在酶解温度（37℃）恒定的条件下，以加酶量、酶解时间、料液比和酶解pH为因素，分别设置4个水平进行正交实验［14-15］，优化蛴螬抗菌肽制备条件（表1）。

表1 正交实验各因素及水平

1.2.7 蛴螬抗菌肽稳定性研究 （1）蛴螬抗菌肽酸碱度稳定性研究。各取酶解产物1.0 mL，用0.2 mol/L NaOH和0.2 mol/L HCl 配制一系列pH值为 1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、9.00、10.00、11.00、12.00、13.00的溶液，取100.00 μL样品进行抑菌实验。对照实验组为一系列不同pH值的溶液（不加抗菌肽样品）。

（2）蛴螬抗菌肽的温度稳定性研究。各取酶解产物 1.00 mL，分别在 20、30、40、60、80、100℃条件下放置30 min，处理完成后放置至室温，取100.00 μL样品进行抑菌实验。空白对照样品为无菌蒸馏水。

（3）蛴螬抗菌肽盐浓度稳定性研究。各取酶解产物1.00 mL，用NaCl 配制一系列盐浓度为 0、10.00、20.00、40.00、60.00、80.00、100.00、120.00、140.00、160.00、180.00、200.00 mmol/L的溶液，取100.00 μL样品进行抑菌实验。对照样品为一系列不同盐浓度的溶液（不加抗菌肽样品）。

（4）蛴螬抗菌肽水解稳定性研究。各取酶解产物1.00 mL，根据上述配制方法比例配制模拟胃液和模拟肠液，分别在37℃中水浴处理30 min，以未处理的抗菌肽溶液和不添加胃/胰蛋白酶的人工胃/胰液为对照。取100.00 μL样品进行抑菌实验。

2 结果与分析

2.1 加酶量对蛴螬酶解物抑菌效果的影响

图1 加酶量对蛴螬酶解物抑菌效果的影响

如图1所示，当加酶量在20.00～40.00 ku/g范围增加时，蛴螬蛋白酶解产物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果均增强，而当加酶量大于40.00 ku/g时，酶解产物的抑菌效果变弱；加酶量大于80.00 ku/g时，酶解产物对两种实验菌几乎没有抑制效果。产生这种效果的可能原因是：加酶量增大时，胰蛋白酶对蛴螬蛋白的水解程度增强，将具有抗菌活性的多肽水解为分子量更小的多肽，从而使抗菌肽失去了抗菌活性［16］。

2.2 酶解时间对蛴螬酶解物抑菌效果的影响

如图2所示，当酶解时间在30～90 min时，蛴螬酶解产物对实验菌的抑制效果随着酶解时间的延长呈现增强的趋势，当酶解时间超过90 min时，酶解产物的抑菌效果明显降低。实验认为，酶解时间为90 min时，酶解产物的抑制效果最好。这是由于长时间的酶解会将抗菌肽酶解为更小的分子，这些小分子肽是不具有抑菌活性的，因此酶解物的抑菌活性会在90 min以后开始下降。

图2 酶解时间对蛴螬酶解物抑菌效果的影响

2.3 料液比对蛴螬酶解物抑菌效果的影响

由图3可知，在实验条件内，酶解产物的抑菌效果随着料液比的增加呈现先升后降的趋势，当料液比为1∶20 （g/mL）时，胰蛋白酶水解物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果最好。

2.4 pH对蛴螬酶解物抑菌效果的影响

由图4可知，在实验选取的pH范围内，当pH小于8.00时，胰蛋白酶酶解产物的抑菌效果随着pH的增大而增加，但当pH为7.50和8.00时，酶解产物的抑制效果没有明显改变，当pH大于8.00时，酶解产物的抑菌效果明显下降，因此pH8.00为制备蛴螬抗菌肽的最佳pH值。

图3 料液比对蛴螬酶解物抑菌效果的影响

图4 pH对蛴螬酶解物抑菌效果的影响

2.5 胰蛋白酶酶解蛴螬蛋白条件优化

从表2可以看出，当蛴螬蛋白酶解度为15.21%、15.61%和16.03%时，酶解液对两种实验菌的抑制效果差别不大，分别为9 mm和11 mm左右。当酶解度较低如10.11%时，对实验菌株的抑制效果不佳，可能是由于酶解程度不够；当酶解程度较高如20.01%时，对实验菌株的抑制效果也不是最好，可能是由于酶解程度过高，抗菌肽片段太短造成的。通过极差分析可知，各因素对蛴螬蛋白酶解度的影响效果不一样，各因素的显著性依次为加酶量（A）>酶解时间（B）>pH（D）>料液比（C），胰蛋白酶酶解蛴螬蛋白实验中各实验因素影响金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑制效果的主次顺序为：加酶量（A）＞酶解时间（B）＞料液比（C）＞ pH（D）。

表2 胰蛋白酶作用效果正交试验L16

对大肠杆菌而言，胰蛋白酶酶解制备抗菌肽的最优水平组合为A2B1C2D3和A2B3C4D1即当加酶量为40.00 ku/g、酶解时间为30 min、料液比为1∶15 （g/mL）、pH为8.00时，以及当加酶量为40.00 ku/g、酶解时间为90 min、料液比为1∶25、pH为7.00时，酶解产物对大肠杆菌的抑制效果最好，两种酶解条件下，得到的酶解产物对大肠杆菌的抑菌圈直径达到最大，为9.00 mm（牛津杯直径为6.00 mm），这种条件下获得的酶解产物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为10.50、10.60 mm。

对金黄色葡萄球菌而言，胰蛋白酶酶解制备抗菌肽的最优水平组合为A3B3C1D2，即当加酶量为50.00 ku/g、酶解时间为90 min、料液比为1∶10 （g/mL）、pH为7.50时，酶解产物对金黄色葡萄球菌的抑制效果最好，抑菌圈直径达到最大，为11.50 mm，而酶解产物对大肠杆菌的抑菌圈直径为8.70 mm。这与Tsukiyama等［17］的研究结果基本一致，其原因可能与革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞结构有关［18-19］。

为了制备具有更好抑制效果的蛴螬抗菌肽，将酶解脱脂蛴螬蛋白制备抗菌肽的各因素最优水平组合确定为A3B3C1D2，即以加酶量为50.00 ku/g、酶解时间为90 min、料液比为1∶10（g/mL）、pH为7.50的条件酶解制备蛴螬抗菌肽。此时制备的酶解产物对E.coli和S.A的抑菌圈直径分别为8.70、11.50 mm。

2.6 蛴螬抗菌肽的环境稳定性

从图5可以看出，蛴螬抗菌肽在pH为6.00的环境下，抑菌活性最好，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈为11.80 mm，对大肠杆菌的抑菌圈为9.00 mm。当pH增加到8时，抗菌肽的抑菌活性急剧下降。这与抗菌肽的蛋白特性有关，只有当pH小于蛋白质等电点时，抗菌肽分子的净电荷才为正；而当pH大于等电点时，抗菌肽分子净电荷为零甚至为负，起不到抗菌的作用。

图5 不同pH下蛴螬抗菌肽的抑菌活性

图6表示的是蛴螬抗菌肽经过不同温度处理30 min后，抑菌活性随温度的变化情况，由于在不同的pH值条件下，蛴螬抗菌肽的抑菌活性会随pH值的改变而改变，故在温度稳定性试验时将pH调整到6.00。蛴螬抗菌肽在低于100℃的温度处理下，仍然保持原有的抗菌活性，而当处理温度超过100℃时，抗菌肽的抑菌活性开始出现明显下降。表明蛴螬抗菌肽能在高温下保持抑菌活性，具有一定的热稳定性。

图6 不同温度下蛴螬抗菌肽的抑菌活性

据报道，环境中的盐浓度对抗菌肽的抗菌活性也有很大影响。从图7可以看出，对于不同的细菌，盐浓度对抗菌肽的抑菌活性影响不同。对金黄色葡萄球菌而言，当盐浓度超过140.00 mmol/L，抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑制效果明显减弱，而且随着盐浓度的升高，抑制活性降低；当盐浓度大于80.00 mmol/L时，抗菌肽对大肠杆菌的抑制活性随着盐浓度的增加而明显减弱，当盐浓度大于180.00 mmol/L时，抗菌肽对大肠杆菌基本没有抑制效果。

图7 盐浓度对蛴螬抗菌肽抑菌活性的影响

由于抗菌肽的蛋白特性，实验研究了蛴螬抗菌肽的耐胃蛋白酶和耐胰蛋白酶水解情况。空白对照表示的是蛴螬抗菌肽在水溶液中对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果。由图8可知，蛴螬抗菌肽在不含胃蛋白酶的模拟胃液中，对实验菌的生长抑制效果有所减弱，而在不加胰蛋白酶的模拟肠液中，抗菌肽对实验菌的生长抑制效果不变。这是由于模拟胃/肠液中各因素综合影响的结果。抗菌肽经过胃蛋白酶处理之后，其对实验菌的抑制效果完全消失；但经过胰蛋白酶处理之后的抗菌肽对实验菌的生长抑制效果略微减弱。表明蛴螬抗菌肽没有抗胃蛋白酶水解的能力，但有较强的抗胰蛋白酶水解能力。

图8 蛴螬抗菌肽的水解稳定性

3 结论与讨论

本研究通过酶解法制备出对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都具有抗菌效果的蛴螬抗菌肽，优化了胰蛋白酶酶解制备抗菌肽的酶解条件，并研究了蛴螬抗菌肽的稳定性，得出以下结论：

胰蛋白酶制备蛴螬抗菌肽的最适条件是加酶量为50.00 ku/g，酶解时间为90 min，料液比为1∶10 （g/mL），酶解pH为7.50。此时，蛴螬蛋白的水解度为15.21%，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制直径分别为11.50 mm和8.70 mm。蛴螬抗菌肽的酸稳定性比较好，但是不具有碱稳定性，最佳pH为6.00；蛴螬抗菌肽具有较好的耐热稳定性；盐浓度对不同的实验菌，影响不同，对大肠杆菌而言，当溶液中的盐浓度大于80.00 mmol/L时，抗菌肽的抑制效果逐渐减弱；对金黄色葡萄球菌而言，当溶液中盐浓度大于180.00 mmol/L时，抗菌肽的抑制效果才开始出现明显下降。蛴螬抗菌肽具有良好的耐胰蛋白酶水解稳定性，但不具有耐胃蛋白酶水解稳定性。

在本研究中，用胰蛋白酶制备得到蛴螬抗菌肽，实现了昆虫资源的有效利用，但制备的蛴螬抗菌肽还只是初步的酶解混合物，抑菌效果还没有达到抗生素的效果，后续工作将对酶解产物进行分离纯化，以提高抗菌效果；另外，制备的抗菌肽虽然有良好的耐胰蛋白酶水解稳定性，但不具有耐胃蛋白酶水解稳定性，因此下一步工作将对抗菌肽进行改性或者制成纳米粒子以提高抗菌肽的稳定性。

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