河南汉族人群精神分裂症患者线粒体ATP6基因9115、9185位点突变分析

何书平，仝冬晓，司沛茹，王丽雯，程美锦，景嘉楠，程晓丽

1)郑州大学基础医学院医学遗传与细胞生物学系 郑州 450001 2)郑州市精神病防治医院精神科 郑州 450005 3)郑州大学附属洛阳中心医院妇产医学部实验室 河南洛阳 471000 4)郑州大学第三附属医院检验科 郑州 450052 5)郑州大学第三附属医院河南省新生儿疾病筛查中心 郑州 450052 6)河南省胸科医院检验科 郑州 450008

精神分裂症是以基本个性，思维、情感、行为的分裂，以及精神活动与周围环境不协调为主要特征的一类最常见的精神病，是目前最严重的一种重型精神病。精神分裂症是一种多基因遗传的复杂性疾病，其病因和发病机制一直是精神病学界研究热点。生命体中大脑是耗能最高的组织器官，大脑能量需求改变是引发精神类疾病的重要原因之一[1]。一些研究[2-3]表明，精神分裂症患者中的线粒体形态学、大脑能量代谢和呼吸链中酶活性等有一定程度的变化，在尸检的大脑组织中，精神分裂症患者纹状体中线粒体结构的完整性与对照组没有差别，但是，尾状核和壳核却只有较少的线粒体，提示这些结构的能量需求减少或者产生能量的能力降低。另外，和对照组相比，精神分裂症患者尾状核和前额叶皮层的少突胶质细胞的线粒体体积、密度有明显的降低，多巴胺神经元的突触前终扣出现线粒体的增生[4]。故线粒体功能障碍可能成为精神分裂症发生的一个重要原因。ATP6基因位于线粒体基因上，其编码的亚基6是组成复合物V的一个重要原件，该亚基参与了质子跨膜转运通道的组装，而线粒体内膜的跨膜质子电动势是能量代谢的驱动力和调节剂。因此，该亚基若发生改变，则很有可能影响能量代谢[5-6]。本研究选取ATP6基因上的9115位点和9185位点进行分析，以观察其对河南汉族人群精神分裂症发生的影响。

1 对象与方法

1.1研究对象病例组共244例，其中男129例，女115例，平均年龄(39.5 ± 4.3)岁，均来自于郑州市精神病防治医院，均根据文献[7]标准确诊为精神分裂症，排除诊断不明的个体，或伴有严重躯体疾病和脑器质性障碍个体，或精神发育迟滞及痴呆患者。对照组选取同期健康体检的无关随机个体260人，其中男143人，女117人，平均年龄(40.3 ± 4.1)岁，与病例组无血缘关系，且家族中无精神病史或自杀者。2组性别构成(χ2=0.719，P=0.397)和年龄(t=1.435，P=0.152)比较，差异均无统计学意义，具有可比性。本研究所有个体间均无亲缘关系，均为河南汉族人，所有患者或其监护人以及正常对照均知情同意。

1.2基因组DNA提取抽取受试者的外周静脉血，经EDTA抗凝，通过标准酚-氯仿法抽提基因组DNA。提取的DNA溶于灭菌的双蒸水中，-20 ℃保存，以备使用。所提DNA样本经微量测定仪测定纯度及浓度达标。

1.3引物合成、PCR反应条件、限制性内切酶酶切、琼脂糖凝胶电泳及DNA测序分析两个位点PCR扩增所需引物、退火温度以及产物大小等见表1，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。两个位点分别使用的限制性内切酶以及酶切片段长度见表2。酶切反应体系为20 μL，包括10×Buffer 2 μL，限制性内切酶1 μL，PCR产物10 μL，ddH2O 7 μL；37 ℃恒温水浴2 h[8]。限制性内切酶均购自宝生物工程(大连)有限公司。PCR产物及酶切产物分别用30 g/L琼脂糖凝胶在110 V电压下电泳40～50 min；紫外凝胶成像系统分析记录电泳结果，并拍照留底。选取两个位点的突变及野生型PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

表1 两个位点引物序列及PCR反应条件

表2 两个位点所用内切酶及酶切片段

1.4统计学处理采用SPSS 17.0进行数据分析。病例组和对照组的年龄比较采用两独立样本的t检验，两组间性别构成和基因突变分析均采用χ2检验，并计算OR值及95%CI。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1线粒体ATP6基因9115位点检测结果病例组中有9例9115A/G突变，对照组中有2例9115A/G突变(χ2=5.025，P=0.025，OR=4.790，95%CI=1.046～21.972)，电泳结果见图1，测序结果见图2。

2.2线粒体ATP6基因9185位点检测结果对244例患者及260例对照样本DNA进行酶切，电泳分析后未见突变(图3)。

1:9115G(201 bp);2～7:9115A(176 bp+25 bp);M:Marker图1 线粒体ATP6基因9115位点EcoRⅠ酶内切PCR产物电泳图

A：ATP6基因9115A;B：ATP6基因9115G图2 线粒体ATP6基因9115位点突变测序图

1～3:9185T(107 bp+24 bp);4:PCR产物(131 bp);M:Marker图3 线粒体ATP6基因9185位点Apa Ⅰ酶内切PCR产物电泳图

3 讨论

复合物V是线粒体呼吸链的最后一个复合物，即ATP合酶，是一个多亚基复合物，由突出于膜外的可溶性F1和嵌于膜内的F0组成，因此又称F1F0-ATP酶。复合物V在线粒体中通过电化学梯度传递质子，以ADP、Pi及Mg2+为原料合成ATP，为细胞供能。复合物V缺陷主要导致线粒体能量代谢障碍，主要损伤中枢神经系统[9]。线粒体基因ATP6编码的亚基6是组成复合物V的质子跨膜转运通道的一个重要原件，位于F0集团，对质子跨膜运输为细胞供能起到了重要的作用，目前已知的所有母系遗传的原发性ATP合酶缺陷均与亚基6有关[8]。有学者[10]对93例日本精神分裂症患者以及对照组进行全线粒体基因测序，分析发现线粒体ATP6基因非同义突变仅仅在精神分裂症患者中出现。另外有研究[11]表明，线粒体ATP6基因突变与家族性双侧脑纹状体坏死有关。

线粒体ATP6基因位于线粒体基因组nt8527～9207，本研究对线粒体ATP6基因的两个位点9115和9185进行分析，发现病例组和对照组9115位点突变率比较差异有统计学意义，9115位点A→G突变可能增加精神分裂症的发病风险，文献[10]的研究也发现相同结果。LIU等[12]认为线粒体ATP6基因的9115位点的非同义突变可能通过影响线粒体功能而引起双向情感障碍和抑郁症的发生。本研究未发现病例组和对照组中出现9185位点突变。但是9185位点多态性变化引起位于ATP6亚基肽链C末端附近220的氨基酸在脯氨酸和亮氨酸之间变化，有研究[13]表明9185位点T→C的错义突变引起线粒体功能失调和周围神经病变，进而引起加拿大一个家族出现了家族性Leigh综合征。故该位点是一个功能性位点，对该位点仍需进行深入的研究。

精神分裂症发病机制的研究[14-15]中较为多见的是单胺类递质、神经内分泌、神经再生障碍等学说。以线粒体基因突变为精神分裂症病因学的研究近年来虽然越来越多地受到关注，但研究[16]多集中于线粒体rRNA基因变异、线粒体tRNA基因变异。其他研究的欠缺使线粒体DNA变异与精神分裂症的关系纷争不断，线粒体在精神分裂症中的作用尚未完全阐明，各种研究都亟待丰富。

[1] 刘兆云,陈刚.线粒体功能异常与精神分裂症研究进展[J].精神医学杂志,2013,26(4):311

[2] BANDELT HJ,OLIVIERI A,BRAVI C,et al. Distorted mitochondrial DNA sequences in schizophrenic patients[J].Eur J Hum Genet,2007,15(4):400

[3] ICHIKAWA T,ARAI M,MIYASHITA M,et al.Schizophrenia: maternal inheritance and heteroplasmy of mtDNA mutations[J].Mol Genet Metab,2012,105(1):103

[4] ANGLIN RE,MAZUREK MF,TARNOPOLSKY MA,et al.The mitochondrial genome and psychiatric illness[J].Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet,2012,159B(7):749

[5] MARAZZITI D,BARONI S,PICCHETTI M,et al.Psychiatric disorders and mitochondrial dysfunctions[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2012,16(2):270

[6] 田园如画,周中和,陈会生.腺苷酸活化蛋白激酶在缺血预处理诱导的神经保护中的作用[J].解放军医学杂志,2015,40(5):366

[7] 美国精神医学学会.张道龙，译.美国精神障碍诊断与统计手册[M].5版.北京:北京大学出版社,2014.

[8] 孙逸杰,景戈翰,杨菁,等.TFAM基因rs10826178与rs4390300两多态位点与精神分裂症的关系[J].郑州大学学报(医学版),2015,50(6):773

[9] 李溪远.线粒体呼吸链酶复合物V缺陷与线粒体病[J].中国当代儿科杂志,2013,15(7):596

[10]CHINNERY PF,HOWELL N,ANDREWS RM,et al.Clinical mitochondrial genetics[J].J Med Genet,1999,36(6):425

[11]UENO H,NISHIGAKI Y,KONG QP,et al.Analysis of mitochondrial DNA variants in Japanese patients with schizophrenia[J].Mitochondrion,2009,9(6):385

[12]LIU VW,YANG HJ,WANG Y,et al.High frequency of mitochondrial genome instability in human endometrial carcinomas[J].Br J Cancer,2003,89(4):697

[13]MUNAKATA K,FUJII K,NANKO S,et al.Sequence and functional analyses of mtDNA in a maternally inherited family with bipolar disorder and depression[J].Mutat Res,2007,617(1/2):119

[14]王丽雯,何书平,张景亮,等.ESR1基因单核苷酸多态性及单倍型与精神分裂症的关联研究[J].中华医学遗传学杂志,2013,30(1):21

[15]刘书莲,程晓丽,温雯静,等.多巴胺D2、D3受体基因多态性与汉族人精神分裂症相关研究[J].中国神经精神疾病杂志,2012,38(3):155

[16]BI R,TANG JS,ZHANG W,et al.Mitochondrial genome variations and functional characterization in Han Chinese families with schizophrenia[J].Schizophr Res,2016,171(1/3):200