Mcl-1 siRNA转染对EC9706细胞紫杉醇化疗敏感性的影响

秦甜甜，刘卫华，张雪燕，李蕾蕾，霍俊峰，石晓丽，王 淙

郑州大学药学院 郑州 450001

Mcl-1作为Bcl-2家族蛋白之一，在肿瘤的发生发展中起到重要的抑制凋亡作用。研究[1-2]表明多种癌症中Mcl-1的过度表达导致细胞凋亡抑制并产生肿瘤细胞耐药现象。食管癌的死亡率在全世界范围内排名第六[3]。在我国食管癌以食管鳞癌为主，是常见的消化系统恶性肿瘤之一[4]。临床上常使用紫杉醇联合化疗治疗食管鳞癌。本实验旨在探讨基因靶向治疗与传统化疗药紫杉醇联合作用对食管鳞癌EC9706细胞增殖和凋亡的影响，为食管鳞癌的治疗提供新的方法和思路。

1 材料与方法

1.1材料正常食管上皮Het-1细胞及食管鳞癌EC9706细胞株由郑州大学药物研究院保存。RPMI 1640培养基、胰蛋白酶消化液及BCA蛋白定量试剂盒(北京索莱宝公司)，标准胎牛血清(以色列BI公司)，Mcl-1和β-actin抗体(南京恩晶生物公司)，凋亡检测试剂盒(南京凯基生物公司)，LipofectamineTM2000 转染试剂及Mcl-1 siRNA(上海吉玛基因公司)。

1.2细胞培养Het-1及EC9706细胞培养于含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，在37 ℃、体积分数5%CO2加湿环境中培养，2～3 d传代1次，隔天更换培养基，取处于对数生长期的细胞用于后续实验。

1.3Westernblot检测两种细胞中Mcl-1蛋白的表达收集Het-1细胞及EC9706细胞，PBS清洗2遍，加入裂解液置于冰上裂解30 min，低温离心机4 ℃、12 000 r/min离心4 min，收集上清，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。100 ℃水浴变性后通过SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，采用湿转法将目标蛋白转移至硝酸纤维素膜。含5 g/L脱脂牛奶的Tris缓冲盐水室温下封闭1～2 h，加入一抗(Mcl-1 按1500稀释, β-actin按15 000稀释)后在4 ℃环境下孵育过夜。TBST洗膜3次，在室温下加二抗孵育2 h。ECL发光显色拍照。使用Image J软件分析条带，以目的条带和β-actin条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.4Mcl-1siRNA细胞转染取对数生长期的EC9706细胞接种至6孔板，细胞过夜贴壁后，按照转染试剂操作说明书，将30 nmol/L Mcl-1 siRNA(正义链:5’-CCAAGGCAUGCUUCGGAAATT-3’;反义链:5’-UUUCCGAAGCAUGCCUUGGTT-3’)， 通过转染试剂LipofectamineTM2000转入EC9706细胞中。以未转染细胞为对照。24 h后收集细胞，采用Western blot法检测Mcl-1蛋白表达水平，以评价干扰效果。

1.5细胞增殖检测分别收集转染和未转染Mcl-1 siRNA的EC9706细胞，用完全培养基稀释后以每孔4 500个细胞的密度接种至96孔板。细胞过夜后分别加入含0.20、0.40、0.80、1.60、3.20、6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/L紫杉醇的培养基，即Mcl-1 siRNA+紫杉醇组与紫杉醇组。48 h后，每孔加入20 μL 500 mg/L MTT，37 ℃继续孵育4 h后弃上清，每孔加入150 μL DMSO，置于摇床振荡10 min，570 nm处测定吸光度。增殖抑制率=(对照孔吸光度-实验孔吸光度)/(对照孔吸光度- 空白孔吸光度)×100%。实验重复3次。

1.6细胞凋亡检测收集转染和未转染Mcl-1 siRNA的EC9706细胞接种至6孔板，加入含0.4 μmol/L紫杉醇的完全培养基继续培养24 h后,使用不含EDTA的胰蛋白酶消化，按照凋亡检测试剂盒说明书操作，主要步骤如下：每孔细胞收集后重悬于500 μL Binding buffer，5 μL Annexin V和5 μL PI避光染色15 min。使用BD LSRFortessaTM流式细胞仪在1 h内上机检测细胞凋亡情况。另设未转染也未经紫杉醇处理的EC9706细胞为空白对照。实验重复3次。

1.7统计学处理使用SPSS 17.0处理数据。采用两独立样本t检验比较Het-1细胞及EC9706细胞Mcl-1蛋白表达的差异及评价转染效果，采用2× 9析因设计的方差分析比较转染和未转染Mcl-1 siRNA的EC9706细胞经不同浓度紫杉醇处理后细胞增殖抑制率的差异，采用单因素方差分析比较空白对照、经紫杉醇处理的EC9706细胞及转染Mcl-1 siRNA并经紫杉醇处理的EC9706细胞凋亡率的差异。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1正常细胞和食管鳞癌细胞中Mcl-1蛋白的表达结果见图1。EC9706细胞中Mcl-1的相对表达量为(37.8±2.0)%，高于Het-1细胞(12.6±1.0)%(t=19.289，P<0.001)。

图1 Mcl-1在Het-1及EC9706细胞中的表达

2.2转染Mcl-1siRNA后EC9706细胞中Mcl-1蛋白的表达Mcl-1的干扰效果见图2，EC9706细胞中Mcl-1的表达为(117.57±5.17)%，高于转染Mcl-1 siRNA的EC9706细胞(19.89±0.82)%，t=32.346，P<0.001。

2.3转染Mcl-1siRNA的EC9706细胞经紫杉醇处理后增殖抑制率的变化结果见表1。

2.4转染Mcl-1siRNA的EC9706细胞经紫杉醇处理后凋亡率的变化空白对照、经紫杉醇处理的EC9706细胞及转染Mcl-1 siRNA并经紫杉醇处理的EC9706细胞凋亡率分别为(1.70±0.53)%、(18.70±0.65)%和(28.00±2.13)%，3组间差异有统计学意义(F=305.473，P<0.001)，组间两两比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

1、2：分别为未转染和转染Mcl-1 siRNA的EC9706细胞图2 EC9706细胞中的Mcl-1的干扰效果

表1 转染Mcl-1 siRNA的EC9706细胞经紫杉醇处理后增殖抑制率的变化(n=3)

F组间=73.201,P<0.001;F浓度=449.458,P<0.001;F交互=7.311,P=0.001；*：与未转染Mcl-1 siRNA组相比，P<0.05

3 讨论

紫杉醇是从红豆杉科属植物短叶红豆杉中分离出的一种二萜烯类药物。20世纪80年代中期，Horwitz首次揭示了紫杉醇的抗肿瘤机制主要为通过诱导和促进微管蛋白聚合，导致微管束排列异常，进而抑制细胞有丝分裂，使细胞停滞在G2/M期[5]。相继有研究[6-9]发现紫杉醇可以用于治疗头颈部肿瘤、卵巢癌、肺癌等多种癌症。

由线粒体引发的细胞内源性凋亡是肿瘤细胞经典的凋亡通路之一[10]。Bcl-2家族蛋白是控制细胞生存死亡的关键蛋白，其中抑制凋亡蛋白包括Bcl-2、Mcl-1、Bcl-xl等，这些抑制凋亡蛋白一直是肿瘤分子靶向治疗研究的热点[11-12]。本研究证实Mcl-1蛋白在食管鳞癌EC9706细胞中高表达，因此靶向设计了siRNA干扰EC9706细胞中Mcl-1的表达。干扰Mcl-1基因后，在1.60至25.00 μmol/L紫杉醇作用下，EC9706细胞的增殖抑制率增加；而当紫杉醇浓度为50.00 μmol/L时，无论是否敲除Mcl-1都能抑制细胞增殖，主要原因可能为大剂量紫杉醇本身即可抑制肿瘤细胞增殖。此外，本研究还发现与单用紫杉醇相比，干扰Mcl-1基因后0.4 μmol/L紫杉醇即可使EC9706细胞凋亡率升高。

综上所述，通过干扰抗凋亡基因Mcl-1可以抑制EC9706细胞增殖，促进细胞凋亡，增强EC9706细胞对紫杉醇的敏感性；实验结果为提高食管鳞癌化疗敏感性，改善临床疗效提供了新方法。

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