自噬对MCF-7细胞紫杉醇化疗敏感性的影响

石 瑛，路 璐，王云凤，任静静，贾莉婷，常爱民，马 丹，魏园玉

1)郑州大学第三附属医院检验科 郑州 450052 2)郑州大学检验系 郑州 450052

紫杉醇是治疗乳腺癌的一线化疗药物[1-2]，但部分患者对紫杉醇耐药。研究[3]发现，紫杉醇在发挥其药效时，不仅可诱导乳腺癌细胞凋亡，还可通过PI3K/Vps34途径抑制自噬。自噬是公认的细胞对抗不良生长环境的一种重要保护机制。正常细胞受缺血、缺氧等刺激后，自噬可将细胞内受损细胞器或变性蛋白质降解并提供能量供细胞再利用，有利于细胞的生长与恢复[4]。在肿瘤治疗过程中，肿瘤细胞正是利用了自噬对细胞的保护作用，抵抗化疗药物对肿瘤细胞的损伤作用，阻碍化疗药物诱导的细胞凋亡；自噬效应可降低肿瘤细胞对药物的敏感性而导致耐药[5-7]。陈莎等[8]研究发现，抑制自噬可增强三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞和MDA-MB-468细胞对紫杉醇的敏感性。本研究以乳腺癌MCF-7细胞为研究对象，探讨利用自噬抑制剂3-MA抑制自噬是否可以提高MCF-7细胞对紫杉醇的敏感性，从而为乳腺癌的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1材料MCF-7细胞购自美国ATCC细胞库。胎牛血清(FBS)购自浙江天杭生物科技股份有限公司，RPMI 1640不完全培养基购自北京索莱宝科技有限公司，兔抗人p62单克隆抗体购自美国Abcam公司，兔抗人LC3B(包含LC3B-Ⅰ和LC3B-Ⅱ)单克隆抗体购自美国CST公司，兔抗人GAPDH多克隆抗体和羊抗兔IgG-HRP购自生工生物工程(上海)有限公司，细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司，细胞增殖毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)购自日本同仁化学研究所，紫杉醇购自西安昊轩生物科技有限公司，3-MA购自美国Selleck公司。

1.2细胞培养MCF-7细胞培养于含体积分数10%灭活FBS的RPMI 1640完全培养基中，并置于37 ℃、体积分数 5% CO2培养箱中培养，待细胞融合度达到80%～90% 时进行传代或用于后续实验。

1.3紫杉醇作用浓度的筛选取对数生长期的MCF-7细胞，按8×103个/孔接种到96孔板，待细胞融合度达80%～90%时，用不同浓度紫杉醇[终浓度分别为0.0(对照)、7.8、15.6、31.2、125.0、500.0和1 000.0 nmol/L]处理24 h。弃掉原培养基，加入100 μL不完全培养基及10 μL CCK-8溶液，继续培养1 h后使用酶标仪测定450 nm处的OD值并计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。每组设4个平行孔，共进行3次实验。通过绘制标准曲线计算紫杉醇的IC30值。

1.4紫杉醇作用时间的筛选用IC30浓度的紫杉醇分别处理MCF-7细胞0、6、12、24 h后，用RIPA细胞裂解液裂解各组细胞，提取总蛋白，每组取20 μg蛋白样品与5×蛋白上样缓冲液以体积比41混匀，煮沸变性。用120 g/L十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，然后将分离的蛋白转到0.22 μm PVDF膜，放入含有50 g/L脱脂奶粉的封闭液中室温封闭1 h后，分别加入稀释后的兔抗人LC3B单克隆抗体和兔抗人GAPDH多克隆抗体(均按11 000稀释)，4 ℃过夜；次日TBST洗涤PVDF膜，加入羊抗兔IgG-HRP(按110 000稀释)，室温孵育1 h；TBST再次洗膜后采用高灵敏度化学发光显色。采用Image J软件分析条带灰度值。目的蛋白的相对表达量以目的蛋白与GAPDH条带灰度值的比值表示。每组设置3个平行孔，共进行3次实验。

1.5流式细胞术检测细胞凋亡情况取MCF-7细胞，分为空白组、紫杉醇组(IC30紫杉醇处理细胞24 h)、3-MA组(5 mmol/L 3-MA处理细胞24 h)和3-MA+紫杉醇组(5 mmol/L 3-MA预处理细胞2 h后IC30紫杉醇处理细胞24 h)。收集各组细胞，用预冷的0.01 mol/L PBS洗涤1～2次后，加入100 μL Binding buffer制成1×106mL-1细胞悬液。加入5 μL FITC标记的磷脂结合蛋白Annexin V和5 μL碘化丙啶轻轻混匀，室温避光孵育15～30 min。最后，加入400 μL Binding buffer重悬细胞，30 min内上机检测。细胞获取与数据分析由BD FACSDiva.8软件进行。细胞凋亡率以早期凋亡率和晚期凋亡率的总和进行计算。每组设置3个平行孔，共进行3次实验。

1.6Westernblot法检测细胞中自噬相关蛋白表达情况按照1.5分组处理MCF-7细胞后，按1.4中Western blot方法检测LC3B和p62蛋白的表达，其中一抗兔抗人单克隆抗体按11 000稀释。

1.7CCK-8法检测细胞增殖情况另取对数生长期的MCF-7细胞，按8×103个/孔接种到96孔板，待细胞融合度达80%～90%时，首先用5 mmol/L 3-MA预处理2 h，然后加入终浓度为IC30的紫杉醇处理24 h；或者仅用紫杉醇处理MCF-7细胞24 h。最后按照1.3中方法检测并计算增殖抑制率。

1.8统计学处理采用SPSS 21.0处理数据。采用单因素方差分析比较紫杉醇处理不同时间MCF-7细胞LC3B蛋白的表达，采用2×2析因设计方差分析比较紫杉醇和3-MA对MCF-7细胞IC3B蛋白和p62蛋白表达的影响，采用两独立样本t检验比较紫杉醇联合3-MA对细胞增殖的影响。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1紫杉醇作用浓度的筛选7.8、15.6、31.2、125.0、500.0、1 000.0 nmol/L紫杉醇处理24 h对MCF-7细胞的增殖抑制率分别为(5.9±1.8)%、(13.5±0.7)%、(27.9±2.1)%、(37.7±1.3)%、(44.6±1.0)%、(67.4±1.4)%，通过绘制标准曲线计算紫杉醇的IC30为31.2 nmol/L，将此浓度用于后续实验。

2.2紫杉醇作用时间的筛选Western blot结果见图1。31.2 nmol/L紫杉醇处理0、6、12和24 h， MCF-7细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值分别为：(1.39±0.22)、(0.99±0.09)、(0.71±0.09)和(0.50±0.36)，LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值随紫杉醇作用时间的延长有降低的趋势(F=31.080,P<0.001)，因此选用24 h作为紫杉醇处理MCF-7细胞的时间。

2.3 4组细胞凋亡率及LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、p62表达水平的比较Western blot结果见图2和表1。结果显示，紫杉醇或3-MA单用均可促进MCF-7细胞凋亡，降低LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值，升高p62蛋白水平，并且二者联用具有协同作用。

图1 紫杉醇作用不同时间MCF-7细胞中LC3B蛋白的表达

图2 4组MCF-7细胞自噬相关蛋白的表达

表1 4组MCF-7细胞凋亡率及自噬相关蛋白表达的比较

2.4 3-MA与紫杉醇联用对MCF-7细胞增殖的影响自噬抑制剂3-MA预处理后，IC30的紫杉醇对MCF-7细胞的增殖抑制率较单用紫杉醇升高[(42.3±2.2)%vs(29.2±4.3)%，t=4.670,P=0.010]。

3 讨论

紫杉醇自1965年问世以来，一直是治疗各种癌症的一线抗癌药物，但是随着用药时间的延长，癌细胞对紫杉醇的敏感性逐渐降低，因此，提高紫杉醇对肿瘤细胞的敏感性逐渐受到重视。

自噬是细胞抵御不良环境的一种自我保护机制，将衰老或受损的蛋白质、细胞器及其他细胞成分运送到溶酶体进行降解和再循环而保护细胞，维护细胞稳态[9-11]。自噬的完成需要多种自噬相关因子参与，其中LC3B和p62是自噬形成与发生的重要标志物，通常用于判定是否可以形成一个完整的自噬流。LC3B分为LC3B-Ⅰ和LC3B-Ⅱ两种形式，当自噬上调时，LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ转化，LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值增高。p62在自噬溶酶体形成过程中可被降解，所以其表达降低说明自噬溶酶体形成，自噬上调。随着对自噬研究的深入，发现自噬不仅与肿瘤的发生、发展有关[12-13]，还与肿瘤细胞耐药密切相关[14-15]。

Veldhoen等[3]发现紫杉醇在乳腺癌细胞中通过PI3K/Vps34途径抑制自噬的发生，进而减弱了肿瘤细胞对药物损伤的抵抗作用，因此抑制肿瘤细胞内的自噬有可能成为改善化疗疗效和放疗敏感性的新策略。本研究结果显示，紫杉醇可以抑制MCF-7细胞增殖，且对细胞内自噬水平具有抑制作用，因此自噬可能参与了紫杉醇发挥杀伤效应的过程。进一步的研究发现与单用紫杉醇相比，自噬抑制剂3-MA与紫杉醇联合应用后，MCF-7细胞增殖抑制率和凋亡率均进一步升高，细胞内LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值降低，p62表达增高，说明3-MA可有效协助紫杉醇抑制自噬。以上结果表明，抑制自噬可增强MCF-7细胞对紫杉醇的敏感性。临床研究[16]也表明，使用自噬抑制剂氯喹或羟氯喹与化疗药物联合治疗乳腺癌等恶性肿瘤已经取得阶段性成果。

综上所述，自噬与MCF-7细胞对紫杉醇的敏感性密切相关，深入研究自噬影响MCF-7细胞对紫杉醇敏感性的机制，将有助于临床有效解决乳腺癌耐药的问题，并且本研究也为紫杉醇联合自噬抑制剂治疗乳腺癌提供了实验依据。在今后的研究中，我们还需进一步探索自噬影响MCF-7细胞对紫杉醇敏感性的具体机制，同时通过动物实验更深入证明自噬在紫杉醇耐药中的作用。

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