NOX4在BEAS-2B细胞上皮间质转化过程中的作用

薛 腾，赫 欣，任亚南，张 恺，阙菡雅，姚 武，周 舫

1)郑州大学公共卫生学院劳动卫生学教研室 郑州 450001 2)漯河医学高等专科学校预防医学教研室 河南漯河 462000 3)郑州市疾病预防控制中心 郑州 450000

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一类严重的慢性炎症进行性疾病，主要临床特征为气道对外界刺激高反应导致呼吸持续性受阻，主要病理特征为气道和支气管上皮组织发生纤维化而出现气道重塑的现象[1-2]。吸烟、大气污染物中可吸入性颗粒物以及工作环境中的粉尘，均是COPD发病的有害因素[3]。在气道重塑过程中，上皮组织会发生大面积的纤维化，纤维化过程中一个重要的生物学过程是上皮细胞发生上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)[4]。上皮细胞发生EMT后，上皮细胞标志如E-cadherin蛋白逐渐丢失，同时间质细胞标志如Vimentin表达逐渐升高[5]。非吞噬细胞氧化酶4(non-phagocytic oxidase 4,NOX4)的主要功能是产生活性氧(reactive oxygen species, ROS)，ROS可以介导细胞的多种生物学过程，比如增殖、迁移、分化等，并且与EMT进程密切相关[6-7]。转化生长因子β(transforming growth factor β, TGF-β)是一种多功能细胞因子，可以调节细胞的生长、分化等生物学过程，同时可以诱导EMT过程[8-9]。二苯基氯化碘(diphenyliodonium iodide, DPI)可以和NOX家族蛋白的C端和N端特异性结合，进而抑制NOX家族蛋白的表达[10]。本研究中我们用TGF-β刺激人正常肺上皮细胞BEAS-2B以构建EMT细胞模型，然后用DPI特异性抑制NOX4的表达，观察NOX4表达变化是否影响EMT过程，为COPD患者的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料BEAS-2B细胞由新乡医学院吴卫东教授馈赠。TGF-β(美国Peprotech公司)，羊抗鼠IgG二抗、NOX4一抗、Vimentin一抗(美国Santa Cruz公司)，E-cadherin抗体(美国Cell Signaling Technology公司)，胎牛血清(美国Gemini公司)，含双抗RPMI 1640培养基(北京索莱宝公司)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)，ROS检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。CO2培养箱(上海力康生物医疗科技控股有限公司)，DYCZ-24DN电泳仪(北京六一仪器厂)，ECLIPSE TS100-F倒置显微镜(上海Heal Force公司)，Sunrise remote酶标仪(奥地利TECAN公司)，Accuri C6流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2细胞培养用含体积分数10%胎牛血清且含双抗的RPMI 1640培养基复苏、传代、培养BEAS-2B细胞，培养条件为：37 ℃，CO2体积分数为5%，相对湿度为95%。

1.3TGF-β刺激对BEAS-2B细胞EMT相关蛋白表达的影响待BEAS-2B细胞铺满培养瓶的80%～90%时，选取生长状况较好的细胞做饥饿处理。用0.0、1.0、2.5、5.0、10.0 μg/L的TGF-β刺激细胞24 h后，收集细胞，用含PMSF的裂解液提取总蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。将各组蛋白浓度调整一致，按比例加入4×loading buffer后，95 ℃水浴5 min变性。随后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳条件：浓缩胶恒压80 V，电流强度50～70 mA，分离胶恒压120 V。转膜条件：恒流290 mA，根据目标蛋白的相对分子质量调整转膜时间。PVDF膜用含50 g/L脱脂奶粉的TBST封闭，分别用E-cadherin、Vimentin一抗(200 μg/L)孵育，羊抗鼠二抗(100 μg/L)孵育。最后进行ECL显影，经Quantity One定量分析，选定后续实验TGF-β的浓度。实验均重复3次。

1.4细胞分组取对数生长期的BEAS-2B细胞，分为4组。空白对照组：只加入RPMI 1640培养基；TGF-β组：用含有5 μg/L TGF-β的RPMI 1640培养基培养细胞；DPI组：用含有0.5 μg/L DPI的RPMI 1640培养基培养细胞；TGF-β+DPI组：用同时含有5 μg/L TGF-β和0.5 μg/L DPI的RPMI 1640培养基培养细胞。培养24 h后，收集细胞，以备后续检测。

1.5 4组细胞NOX4、E-cadherin、Vimentin蛋白表达的检测同1.3中方法检测4组细胞3种蛋白的表达。实验重复3次。

1.6 4组细胞ROS水平的检测取以上各组细胞，利用荧光探针DCFH-DA检测ROS，用流式细胞仪，488 nm激发光激发，FL1-h收集DCF的荧光信号，用信号强度代表细胞内ROS水平。实验重复3次。

1.7 4组细胞迁移能力检测取BEAS-2B细胞接种于6孔板，待细胞长至90%时，用200 μL的无菌枪头在孔板中间做一条划痕，PBS清洗后，按1.4分组处理24 h，用倒置显微镜拍照、观察，用Photoshop进行宽度分析。划痕宽度为分组处理24 h后划痕宽度与处理前划痕宽度的比值，比值越大，迁移能力越低。实验重复3次。

1.8统计学处理采用SPSS 21.0处理数据。采用单因素方差分析比较不同质量浓度的TGF-β处理后细胞E-cadherin、Vimentin蛋白表达水平的差异，组间两两比较采用LSD-t检验；采用2×2析因设计的方差分析探讨TGF-β和DPI对BEAS-2B细胞NOX4、E-cadherin、Vimentin蛋白表达水平，ROS水平及迁移能力的影响，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1TGF-β刺激对BEAS-2B细胞EMT相关蛋白的影响结果见图1、表1。 由表1可以看出，与0.0 μg/L组相比，5.0 μg/L组E-cadherin表达降低，Vimentin表达升高。TGF-β为10.0 μg/L和5.0 μg/L时，上述2指标差异无统计学意义，因此后续实验中选取TGF-β的质量浓度为5.0 μg/L。

1～5：分别为0.0、1.0、2.5、5.0和10.0 μg/L TGF-β刺激图1 不同质量浓度TGF-β刺激后EMT蛋白变化

表1 不同质量浓度TGF-β刺激后BEAS-2B细胞中EMT相关蛋白的表达

*：与0.0 μg/L组相比，P<0.05；#：与1.0 μg/L组相比，P<0.05；△：与2.5 μg/L组相比，P<0.05。

2.2 4组细胞NOX4、EMT相关蛋白表达水平、ROS水平和划痕宽度比较由图2、表2可知，TGF-β可以增加NOX4、Vimentin、ROS的表达，降低E-cadherin的表达以及划痕宽度；DPI可以抑制NOX4、Vimentin、ROS的表达，增加E-cadherin的表达以及划痕宽度；DPI可拮抗TGF-β对NOX4、E-cadherin、ROS的作用。

1:空白对照组；2:TGF-β组；3:TGF-β+DPI组；4:DPI组图2 4组NOX4及EMT相关蛋白的表达

表2 4组BEAS-2B细胞相关指标的比较(n=3)

3 讨论

根据世界卫生组织发布的数据可以看出，COPD居全球死因的第4位，并且预测在2030年，COPD将升至第3位死因。诱发COPD的因素有很多，如吸烟、大气污染，特别是大气污染物中可吸入性颗粒物PM2.5等[11]。COPD患者往往会发生气道重塑，此时支气管上皮细胞会发生EMT进程[12]。在EMT进程中，细胞内的NOX1/4表达升高，同时ROS产量增加[13]。鉴于NOX4和EMT进程有着密切的联系，我们设计以下实验观察NOX4在BEAS-2B细胞EMT进程中的作用。

我们首先用不同质量浓度的TGF-β刺激BEAS-2B细胞，发现5 μg/L刺激24 h，上皮细胞标志蛋白E-cadherin表达降低，间质细胞标志蛋白Vimentin表达上升，说明5 μg/L的TGF-β刺激24 h可以构建BEAS-2B细胞EMT模型。接下来，我们用DPI抑制TGF-β刺激的BEAS-2B细胞NOX4的表达，观察其对EMT进程的影响。结果显示，在TGF-β诱导BEAS-2B细胞EMT进程时，NOX4表达升高，ROS产量增加，E-cadherin蛋白表达降低。和TGF-β组相比，TGF-β+DPI组NOX4表达降低，E-cadherin蛋白表达有所回升，ROS水平降低。有研究[14]表明，ROS可以作为细胞内的第二信使，促进Smad、Snail等转录因子的表达，进而促进EMT进程。本研究结果同样显示，NOX4被抑制后，ROS产量降低，ROS降低后，不足以维持BEAS-2B细胞的EMT进程，因此EMT进程被中断。划痕实验结果显示，TGF-β诱导的BEAS-2B细胞迁移能力增强，DPI抑制NOX4后，和TGF-β组相比，TGF-β+DPI组细胞的迁移能力有所降低。经历EMT进程后，细胞骨架会发生重建，细胞失去极性，细胞间的连接能力降低，一些促进迁移的蛋白如MMP-1、MMP-9的表达升高，进而促进了细胞的迁移[15-16]。而在本实验中，我们用DPI抑制NOX4的表达，进而BEAS-2B细胞的EMT进程被抑制，最终降低了细胞的迁移能力。

综上所述，抑制NOX4的表达可以降低ROS的产量，进而抑制TGF-β诱导的BEAS-2B细胞EMT进程，最终降低细胞的迁移能力。EMT进程在COPD的发生发展中起着至关重要的作用，研究EMT进程的机制将为COPD的治疗提供新的理论基础。

[1] SOHAL SS.Epithelial and endothelial cell plasticity in chronic obstructive pulmonary disease(COPD)[J].Respir Investig,2017,55(2):104

[2] 孙盼锋,张辉,黄仕夫,等.克拉霉素联合布地奈德对COPD大鼠糖皮质激素抵抗的影响[J].郑州大学学报(医学版),2017，52(3):322

[3] RAFIQ R,PRINS HJ,BOERSMA WG,et al.Effects of daily vitamin D supplementation on respiratory muscle strength and physical performance in vitamin D-deficient COPD patients: a pilot trial[J].Int J Chron Obstruct Pulmon Dis,2017,12:2583

[4] COURTNEY JM,SPAFFORD PL.The role of epithelial-mesenchymal transition in chronic obstructive pulmonary disease[J].Cells Tissues Organs,2017,203(2):99

[5] WANG Y,LIU X,ZHENG H,et al.Suppression of CUL4A attenuates TGF-β1-induced epithelial-to-mesenchymal transition in breast cancer cells[J].Int J Mol Med,2017,40(4):1114

[6] HOLLINS F,SUTCLIFFE A,GOMEZ E,et al.Airway smooth muscle NOX4 is upregulated and modulates ROS generation in COPD[J].Respir Res,2016,17(1):84

[7] WU Q,YAO B,LI N,et al.Nrf2 mediates redox adaptation in NOX4-overexpressed non-small cell lung cancer cells[J].Exp Cell Res,2017,352(2):245

[8] POLIMENI M,GULINO GR,GAZZANO E,et al.Multi-walled carbon nanotubes directly induce epithelial-mesenchymal transition in human bronchial epithelial cells via the TGF-β-mediated Akt/GSK-3β/SNAIL-1 signalling pathway[J].Part Fibre Toxicol,2016,13(1):27

[9] 鲁艳杰，刘绍晨，胡亚涛，等. TGF-β1对人绒毛膜癌细胞上皮间质转化及其迁移能力的促进作用研究[J].解放军医学杂志，2016,41(2):114

[10]DOSOKI H,STEGEMANN A,TAHA M,et al.Targeting of NADPH oxidase in vitro and in vivo suppresses fibroblast activation and experimental skin fibrosis[J].Exp Dermatol,2017,26(1):73

[11]胡国平,钟南山,冉丕鑫,等.中国的大气污染和COPD[J].中国胸心血管外科临床杂志,2016，23(2):107

[12]MAHMOOD MQ,WALTERS EH,SHUKLA SD,et al.β-catenin, Twist and Snail:transcriptional regulation of EMT in smokers and COPD, and relation to airflow obstruction[J].Sci Rep,2017,7(1):10832

[13]KIM H,SUNG JY,PARK EK,et al.Regulation of anoikis resistance by NADPH oxidase 4 and epidermal growth factor receptor[J].Br J Cancer,2017,116(3):370

[14]WANG W,HU Y,WANG X,et al.ROS-Mediated 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase degradation via cysteine oxidation promotes NAD+-mediated epithelial-mesenchymal transition[J].Cell Chem Biol,2018,25(3):255

[15]BAEK SH,KO JH,LEE JH,et al.Ginkgolic acid inhibits invasion and migration and TGF-β-induced EMT of lung cancer cells through PI3K/Akt/mTOR inactivation[J].J Cell Physiol,2017,232(2):346

[16]GULINO GR,POLIMENI M,PRATO M,et al.Effects of chrysotile exposure in human bronchial epithelial cells:insights into the pathogenic mechanisms of asbestos-related diseases[J].Environ Health Perspect,2016,124(6):776