运动预处理对大鼠心脏缺血再灌注损伤的保护作用

路富林，余 琦，魏 明

1)西安医学院体育部 西安 710021 2)西安医学院基础医学部 西安 710021

心血管疾病是目前世界范围内导致死亡的重要原因。心脏发生缺血后，及时有效地恢复血液供应仍是最佳的治疗手段，而再灌注早期会导致心肌损伤进一步加重，形成再灌注损伤[1]。心肌缺血再灌注损伤的机制研究[2]主要集中在钙超载、氧化应激、炎症反应和能量代谢障碍等。有研究表明，适宜的运动对机体有保护作用，可以增强心肌功能，减少冠状动脉粥样硬化性心脏病的发生率和病死率[3]，并可减少缺血再灌注引起的心肌损伤[4]，但具体机制仍不清楚。Sirtuin(简称Sirt)是高度保守的家族，由7个烟酰胺腺嘌呤二核苷酸组成[5]，即Sirt1～7，Sirt1是位于细胞核内的一种去乙酰化酶，具有重要的转录调控因子作用，可调节基因转录、肿瘤发生、氧化应激和炎症反应等过程[6]。本研究采用运动预处理干预大鼠心肌缺血再灌注过程，通过心肌梗死面积、心肌纤维形态变化、细胞凋亡相关蛋白和Sirt1及其底物FOXO1蛋白表达的变化，观察运动预处理是否可以减轻缺血再灌注引起的心肌损伤，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 实验动物 成年健康雄性SD大鼠40只，体重(220±20) g，购于第四军医大学实验动物中心，自由摄食、饮水。室温控制在25 ℃，通风良好，自然光照，控制湿度。

1.1.2 主要试剂和仪器 主要试剂：LDH试剂盒购自美国R&D公司，cTnI试剂盒、SOD活性检测试剂盒以及MDA含量检测试剂盒均购自南京建成生物试剂公司，Cleaved Caspase-3和Cytochrome C抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，Sirt1和Ac-FOXO1抗体购自美国Santa Cruz公司。主要仪器：小动物跑台购自北京中西远大科技有限公司，型号M9W-315587；Centrifuge 5804R低温高速离心机购自德国Eppendorf公司；EPS600电泳仪购自上海天能科技有限公司。

1.2动物分组及运动方式40只大鼠适应性喂养1周后采用随机数字表法分为对照组(n=10)、运动预处理组(n=10)、缺血再灌注组(n=10)和运动预处理+缺血再灌注组(n=10)。对照组和缺血再灌注组不进行运动训练，运动预处理组和运动预处理+缺血再灌注组进行跑台运动，依据Bedford标准制定中等强度的运动方式：跑台坡度为+5°、速度为15 m/min，每天持续30 min，每周训练6 d，为期6周。

1.3在体缺血再灌注模型的制备大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)，切开气管行气管插管，连接小动物呼吸机(潮气量25 mL/kg，频率70次/min)，心电图监测心率。于左心耳下距主动脉根部约2 mm处，用带线缝合针(5-0)穿过约2 mm宽的心肌束(含有冠状动脉左前降支)，在心肌束和结扎线之间放一硅胶管，将线结扎于硅胶管上，造成局部缺血，30 min后松开结扎线，抽出硅胶管恢复冠状动脉左前降支灌注2 h。其中对照组和运动预处理组只开胸、穿线但不结扎。实验中以结扎冠状动脉左前降支后心电图ST段抬高作为结扎成功的标志。

1.4血清中cTnI和LDH含量的检测实验结束后，采集各组大鼠血清，严格按照cTnI和LDH检测试剂盒说明书操作，依次加入各反应液，测定各组大鼠血清中cTnI和LDH的含量。

1.5心肌组织形态学观察实验结束后，各组大鼠均快速打开胸腔，暴露心脏，并立即剪下心脏，用PBS溶液冲洗，每组心脏取心尖部左心室组织，用40 g/L多聚甲醛固定24 h，行常规脱水、石蜡包埋、切片，HE染色后观察心肌组织形态学的变化。

1.6心肌线粒体SOD和MDA的检测实验结束后，各组称取40 mg心尖部左心室组织，放入盛有PBS的1.5 mL EP管中并在冰上剪碎，用PBS溶液反复清洗干净，4 ℃ 1 000g离心1 min，弃上清，然后加入300 μL线粒体分离试剂，冰上匀浆20 min，4 ℃ 3 000g离心5 min，上清移至另一EP管中，4 ℃ 16 000g离心30 min，沉淀即为线粒体。严格按照线粒体MDA和SOD检测试剂盒说明书操作，检测MDA含量和SOD活性。

1.7心肌组织中Sirt1、Ac-FOXO1、CleavedCaspase-3和CytochromeC表达的检测采用Western blot法。称取各组相同重量的心尖部左心室组织，常规方法提取蛋白，BCA比色法进行蛋白定量，蛋白样品与5×Loading Buffer混匀后在沸水中煮7 min。配制SDS-PAGE分离胶，每孔蛋白上样量为35 μg，浓缩胶和分离胶分别以80 V和120 V恒压电泳，采用湿转方式，以90 V恒压转膜70 min，将蛋白转至PVDF膜。用50 g/L脱脂牛奶室温下封闭90 min，然后将目的条带切下，分别用Sirt1(11 000稀释)、Ac-FOXO1(11 000稀释)、Cleaved Caspase-3(11 000稀释)、Cytochrome C(11 000稀释)以及内参GAPDH(15 000稀释)的抗体4 ℃孵育过夜。用Image J 图像分析软件分析各组条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内参条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.8统计学处理采用SPSS 22.0进行数据分析。不同组间血清中LDH和cTnI含量，心肌线粒体中MDA含量和SOD活性，心肌组织中Cleaved Caspase-3、Cytochrome C、Sirt1、Ac-FOXO1蛋白相对表达量的比较均采用2×2析因设计的方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1各组大鼠心肌形态结构的比较HE染色结果见图1。可知，对照组心肌纤维结构清晰、完整，排列整齐，纤维间有分支连接形成网状结构；细胞核位于纤维中，多核，呈蓝色。运动预处理组心肌纤维结构和形态与对照组相似。缺血再灌注组心肌纤维结构紊乱，断裂明显，纤维束及其边界消失，心肌纤维间出现大量空洞，细胞核逸出。运动预处理+缺血再灌注组心肌纤维排列明显改善，纤维断裂减少，少量纤维边界模糊，纤维间缝隙变大。

A：对照组；B：运动预处理组；C：缺血再灌注组；D：运动预处理+缺血再灌注组图1 各组大鼠左心室心肌组织HE染色结果(×400)

2.2各组大鼠血清中LDH和cTnI含量的比较结果见表1。

表1 各组大鼠血清中cTnI和LDH含量的比较

2.3各组大鼠心肌组织中CytochromeC和CleavedCaspase-3蛋白表达的变化结果见图2、表2。

1：对照组；2：运动预处理组；3：缺血再灌注组；4：运动预处理+缺血再灌注组图2 各组大鼠心肌组织中Cytochrome C和Cleaved Caspase-3的表达

表2 各组大鼠心肌组织中Cleaved Caspase-3和Cytochrome C表达的比较

2.4各组大鼠心肌组织中Sirt1和Ac-FOXO1表达的变化结果见图3、表3。

1：对照组；2：运动预处理组；3：缺血再灌注组；4：运动预处理+缺血再灌注组图3 各组大鼠心肌组织中Sirt1和Ac-FOXO1的表达

表3 各组大鼠心肌组织中Sirt1和Ac-FOXO1表达的比较

2.5各组大鼠心肌线粒体SOD活性和MDA含量的变化结果见表4。

表4 各组大鼠心肌线粒体MDA含量和SOD活性的比较

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤是急性心肌梗死溶栓治疗、冠状动脉成形术、心脏外科体外循环等过程中不可避免的病理变化。心肌缺血预处理可以产生具有心肌保护作用的内源性物质，从而减少术后心律不齐的发生，提高心肌存活率。有研究[7-8]证明，运动预处理可以产生类似于缺血预处理的心肌保护作用。运动预处理是指运动训练可以增强心脏对缺血再灌注刺激的耐受性，其心肌保护效应可能是两方面的作用：其一是由于运动可以诱发机体产生内源性的保护因子；其二是运动本身导致心肌出现缺血或相对缺血的现象从而引起缺血预处理的结果。但参与运动预处理心肌保护作用的细胞内信号分子仍不明确，其具体机制还不清楚。

运动会导致机体的耗氧量增加，氧供相对不足，一方面会使细胞内产生过多的氧自由基，从而引起细胞产生氧化损伤；另一方面，为了减轻机体的氧化应激损伤，多种信号通路可通过诱导抗氧化酶的产生，提高心肌清除氧自由基的能力。这种预处理方式有利于增强心脏的抗氧化能力，使其耐受缺血缺氧等伤害性刺激引起的损伤。本研究观察了运动预处理对正常大鼠的影响，结果发现，血清中LDH、cTnI含量以及心肌线粒体MDA含量、SOD活性无变化。这些结果说明，运动本身对心脏并没有造成损伤。

本研究采用在体缺血再灌注模型，观察到缺血再灌注组大鼠血清中cTnI和LDH的含量明显增加，凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3和Cytochrome C的表达明显上调，表明缺血再灌注组心肌损伤加重；而运动预处理可降低缺血再灌注引起的血清中cTnI和LDH含量的增加，下调Cleaved Caspase-3和Cytochrome C的表达。以上结果说明，运动预处理可以减轻缺血再灌注引起的心肌损伤。Sirt1广泛存在于哺乳动物组织细胞的胞浆和胞核内，通过对组蛋白和非组蛋白的去乙酰化，参与代谢、能量调节和许多生理过程，如细胞增殖、分化、衰老和凋亡等[9]。有文献[10]报道，Sirt1在神经退行性疾病、心血管疾病、代谢性疾病和慢性肾病等疾病中均发挥保护作用。另有文献报道，Sirt1在氧化应激时表达上调[11-12]，而且可通过增加FOXO3和FOXO4活性来减少心肌细胞氧化应激损伤[13-14]。本研究发现，缺血再灌注组心肌Sirt1蛋白表达下调，其底物FOXO1乙酰化水平增加，而运动预处理可明显上调Sirt1的表达，降低FOXO1的乙酰化。同时，运动预处理可明显改善缺血再灌注引起的线粒体SOD活性降低，减少线粒体内MDA的含量，说明运动预处理可降低缺血再灌注引起的氧化应激。

综上所述，本研究结果显示运动预处理可通过增加线粒体内SOD活性，减少MDA含量，降低细胞凋亡相关蛋白的表达，从而改善缺血再灌注引起的氧化应激损伤，这可能与Sirt1和FOXO1信号通路有关，但具体机制仍有待进一步研究。

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