中草药饲料添加剂对异育银鲫感染Ⅱ型鲤疱疹病毒的影响

沈兆媛，鲁建飞，许 丹，3，吕利群，3

( 1.上海海洋大学，国家水生动物病原库，上海 201306； 2.上海海洋大学，农业部淡水水产种质资源重点实验室， 上海 201306； 3.上海海洋大学，水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306 )

异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)是我国主要的淡水养殖鱼类之一，据统计，鲫鱼人工养殖总产量约2.0×106t，其主要养殖品种是异育银鲫[1]。随着养殖产量的增长及养殖区域的扩大，日益恶劣的养殖生态环境使得鲫鱼病害频繁发生。近几年来给江苏地区鲫鱼养殖产业带来极大困扰的Ⅱ型鲤疱疹病毒，是高致病性病毒病疱疹病毒性造血器官坏死病的致病病原[2-3]。除Ⅱ型鲤疱疹病毒对鲤科鱼类造成较大的危害外，Ⅰ型鲤疱疹病毒和Ⅲ型鲤疱疹病毒对鲫鱼及金鱼(Carassiusauratus)养殖亦有一定危害。Ⅰ型鲤疱疹病毒引发鲤痘疮，Ⅲ型鲤疱疹病毒感染鲤鱼(Cyprinuscarpio)和锦鲤(C.carpiovar. koi)且有极高的致死率[4]。Ⅱ型鲤疱疹病毒感染鲫鱼后，可在鱼体表、鳃、脾脏、肾脏等组织器官明显观察到出血症状。

目前采用有效的药物治疗感染Ⅱ型鲤疱疹病毒的鲫鱼尚未见报道。中草药应用于中国人类医疗中历史悠久，因其兼具营养性及药用性的双重作用受到人们的广泛关注[5]。中草药添加剂与抗生素和其他化合物添加剂相比，其优势在于成本低、药物残留及副作用小、资源丰富。水产养殖中用来抑制病原菌繁殖，增强非特异性免疫的中草药有穿心莲(Andrographispaniculata)、五倍子(Melaphischinensis)、当归(Angelicasinensis)、 金银花(Lonicerajaponica)、鱼腥草(Houttuyniacordata)、黄芪(Astragalus)、黄芩(Scutellariabaicalensis)、大蒜(Alliumsativum)、苦参(Sophoraflavescens)、淫羊藿(Epimedium)、石榴皮(Punicagranatum)、菖蒲(Acoruscalamus)等[6]。Harikrishnan等[7]利用大黄(Rheumofficinale)提取物投喂异育银鲫，可显著提高其非特异性免疫能力。袁春涛等[8]投喂不同含量的中草药组方饲料及强普素组方饲喂异育银鲫，结果发现，投喂含0.5%的中草药饲料能显著提高异育银鲫巨噬细胞吞噬力和呼吸爆发反应氧的产生。李俊超等[9]使用天然植物药物处理病毒后再感染细胞，观察到在一定含量下板蓝根(Isatistinctoria)注射液对锦鲤疱疹病毒有较弱的直接杀灭作用，而银黄、炎琥宁等没有直接杀灭病毒的效果。各类中草药提取物的应用研究也表明，香菇多糖、黄芪多糖、大黄蒽醌提取物等可提高水产动物的非特异性免疫能力与抗病力[10]。虽然在饲料中添加中草药并应用于养殖生产实践已有诸多报道，但是针对抗Ⅱ型鲤疱疹病毒效果的中草药尚未有较大进展。笔者选用黄芪、大黄、板蓝根、穿心莲等4种具有抗Ⅱ型鲤疱疹病毒潜力的天然中草药作为定制饲料添加剂，旨在为建立有效的防控Ⅱ型鲤疱疹病毒技术提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

试验鱼购自江苏省异育银鲫大丰养殖基地；板蓝根、大黄、黄芪、穿心莲购自同仁堂药店(上海市东方路店)；饲料原料均由盐城市恒兴饲料有限公司提供；Ⅱ型鲤疱疹病毒病毒株由本实验室分离并保存；血液/组织/细胞基因组提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；rTag酶、实时荧光定量PCR试剂盒，购自宝生物工程(大连)有限公司；ACD血液抗凝剂、引物合成均来自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 试验饲料

试验饲料主要原料为面粉、豆粕、鱼粉，按照《鱼类营养需求》(1993)鱼类营养标准配置基础饲料，其营养水平见表1。在基础饲料中分别添加0(对照组)、10 g/kg的板蓝根、大黄、黄芪、穿心莲配置成5 种试验饲料。饲料原料及中草药经粉碎后过80目筛，混匀后加水压成粒径为2.0～2.5 mm的颗粒料，自然晾干后密封4 ℃保存待用。

表1 基础饲料组成及营养水平(风干基础) %

注：1)预混料为每千克饲料提供:VC磷酸酯：200 mg;鱼多

维：200 mg; 鱼多矿：600 mg.2)计算值.

1.3 试验设计与饲养管理

选用体质量为(100±10) g体型均匀的健康异育银鲫，随机分为5组(每组3个重复，每个重复40尾)，分别饲喂在基础饲料中添加10 g/kg(板蓝根、大黄、黄芪、穿心莲)的试验饲料。试验鱼暂养在水族箱中一周，水族箱半径0.5 m，高1 m，水体积为0.628 m3，每日9:00、17:00投喂饲料约鱼体质量的2%，每次投喂后换水1/3。试验期间保持水温在(22±1) ℃。

1.4 Ⅱ型鲤疱疹病毒感染异育银鲫

病毒悬液制备：攻毒，将-80 ℃保存的病鱼组织利用玻璃研磨器研磨后，1×磷酸盐缓冲液以1∶5比例稀释组织匀浆液后混匀室温放置1 h，以3000 r/min离心30 min后，吸取上清液弃沉淀，再次以5000 r/min离心30 min，吸取上清液弃沉淀，以8000 r/min离心上清液30 min，过0.45 μm滤膜收集病毒液4 ℃保存备用。定量稀释病毒悬液至病毒量为1.08×107个/mL，取病毒液1 mL腹腔注射异育银鲫，对照组按同样方法注射灭菌过的1 mL磷酸盐缓冲液。感染期间保持水温约23 ℃，每4 h观察一次试验组并记录死亡情况。

1.5 Ⅱ型鲤疱疹病毒鉴定

取10 μL发病鱼的抗凝血液置于1.5 mL离心管中，利用血液DNA提取试剂盒提取DNA,方法参照试剂盒说明书。提取DNA完毕后，利用Nano Drop 2000测定DNA含量。鉴定Ⅱ型鲤疱疹病毒引物序列F: 5′-ctt tag cgt cag gtc cat aga gg-3′、 R: 5′-cgt cag tcc ctg gca gaa ata ag-3′。PCR反应体系为50 μL：引物浓度为10 μmol/L 各1 μL;10×Buffer 5 μL;dNTP 4 μL; rTaq 酶 0.25 μL;DNA模板1 μL; 加ddH2O至50 μL。反应条件为95 ℃ 3 min; 98 ℃ 10 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,34个循环；72 ℃ 5 min。配置1%含量的琼脂糖胶，进行凝胶电泳，观察结果拍照。

1.6 异育银鲫血液中病毒滴度测定

取样：采用尾静脉取血法，取异育银鲫血液加入ACD血液抗凝剂抗凝，放入1.2 mL冻存管中迅速放入液氮罐中冷冻后转至-80 ℃冰箱保存样品。按照天根血液DNA提取试剂盒说明书操作提取各样品DNA，参照本实验室建立的Ⅱ型鲤疱疹病毒绝对定量方法[11]进行实时荧光定量PCR对病毒滴度进行定量。定量前将已提取的DNA全部稀释为50 ng/μL。病毒荧光定量PCR体系：SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(2×)12.5 μL; PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.5 μL; PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.5 μL; DNA 模板(<100 ng)×2 μL; ddH2O(灭菌蒸馏水)9.5 μL;加水至25 μL。以稀释好的病毒DNA为模板在CFX96TM Real-time PCR Detection System (Bio-Rad)实时荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR反应，计算样品中的Ⅱ型鲤疱疹病毒含量。

2 结 果

2.1 Ⅱ型鲤疱疹病毒鉴定

为确定病毒的活性，对攻毒前的病毒悬液以及攻毒后的异育银鲫血液进行鉴定。攻毒前，取处理过的Ⅱ型鲤疱疹病毒悬液20 μL，利用DNA提取试剂盒提取其总DNA，提取方法同说明书，进行PCR反应，鉴定病毒是否正确。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳，获得一条大小约638 bp的特异性条带，证明病毒悬液是Ⅱ型鲤疱疹病毒悬液。攻毒后各试验组随机取2条异育银鲫的血液10 μL，处理后提取总DNA，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，获得与病毒悬液样品同样大小的一条约638 bp的特异性条带，证明感染成功(图1～2)。

图1 Ⅱ型鲤疱疹病毒悬液DNA凝胶电泳图M：Marker DL2000； 1：Ⅱ型鲤疱疹病毒悬液DNA PCR产物；2：阴性对照 3：双蒸水.

2.2 感染Ⅱ型鲤疱疹病毒后异育银鲫的临床症状

感染Ⅱ型鲤疱疹病毒后，可在各异育银鲫体表观察到体表出血，尤其是胸腹部大面积充血泛红(图3)；鳃部暗红且伴有出血；脾脏肿大，肝脏部位有点状出血；为典型的异育银鲫感染Ⅱ型鲤疱疹病毒症状(图3)。

图2 攻毒后血液中Ⅱ型鲤疱疹病毒 PCR扩增结果M：Marker DL2000；1～10：感染Ⅱ型鲤疱疹病毒血液DNA PCR产物；11 ：阴性对照.

图3 感染Ⅱ型鲤疱疹病毒后异育银鲫临床症状a.胸腹部体表大面积充血；b.鳃暗红出血；c.脾脏肿大、内脏出血.

2.3 异育银鲫死亡率及相对免疫保护率

投喂饲料过程直至攻毒，异育银鲫未出现死亡等异常情况。各均按照鱼体质量的2%投喂饲料，于投喂2个月后进行攻毒。采用实时荧光定量PCR的方法定量Ⅱ型鲤疱疹病毒滴度为1.08×107个/mL。口服穿心莲异育银鲫死亡率为15%；黄芪和板蓝根试验鱼异育银鲫死亡率分别为30%和35%；大黄死亡率为95%；普通饲料投喂攻毒死亡率为100%(表2)。

2.4 感染Ⅱ型鲤疱疹病毒后各不同时间点的病毒滴度情况

利用绝对定量的方法，对Ⅱ型鲤疱疹病毒在各血液内的复制情况进行定量分析。攻毒后0～120 h病毒处在扩增时期，对照组在120 h时病毒滴度达107个/mL，对照组病毒滴度高于其他病毒滴度，且与投喂穿心莲试验组呈差异极显著(P<0.01)。

表2 攻毒后异育银鲫死亡率和相对免疫保护率

图4 异育银鲫感染Ⅱ型鲤疱疹病毒后血液中病毒滴度误差线表示标准偏差，*P<0.01差异极显著.

3 讨 论

3.1 Ⅱ型鲤疱疹病毒感染异育银鲫的临床症状

Ⅱ型鲤疱疹病毒感染导致的异育银鲫造血器官坏死病，使异育银鲫出现体表及内脏器官大面积出血、眼球突出、腹鳍尾鳍发白、鳃组织出血等症状。Wang等[3]首次报道了我国人工养殖的异育银鲫感染Ⅱ型鲤疱疹病毒的病例，在此之后，在北京、武汉、广州等地也在养殖异育银鲫体内检测出Ⅱ型鲤疱疹病毒[12-13]。Ⅱ型鲤疱疹病毒的广泛传播对我国的异育银鲫养殖产业造成了巨大的损失。本研究中，对照组感染Ⅱ型鲤疱疹病毒后，异育银鲫体表呈典型症状(胸腹部体表大面积充血，鳃部暗红出血，脾脏肿大、内脏出血)与林秀秀等[14]报道的异育银鲫感染Ⅱ型鲤疱疹病毒的临床病变外观基本一致 。

3.2 中草药饲料影响异育银鲫对Ⅱ型鲤疱疹病毒的耐受性的机制

本试验中，投喂穿心莲感染后，异育银鲫死亡率为15%，其Ⅱ型鲤疱疹病毒病毒滴度低于对照组。可见穿心莲在Ⅱ型鲤疱疹病毒的攻击下对异育银鲫起保护作用。刘妮等[15]将不同稀释含量的穿心莲水提取物作用于兔肾细胞,通过观察细胞病变,结果表明穿心莲水提取物体外有明显的抗Ⅰ型疱疹病毒的作用。吴莎等[16]证明了穿心莲内酯能对已进入细胞内的甲型流感病毒 H1N1、登革病毒 2 型、柯萨奇 B 病毒以及呼吸道合胞病毒起到一定的抑制作用。 因此，可推断在抗病毒作用中，穿心莲可以对异育银鲫起到一定的保护作用，但不能抑制Ⅱ型鲤疱疹病毒在异育银鲫血液中增殖，也不能杀死Ⅱ型鲤疱疹病毒。投喂黄芪、板蓝根攻毒后，异育银鲫死亡率分别为30%及35%，效果较为相近。黄芪中所含有的黄芪多糖，可以提高异育银鲫机体非特异性免疫，抵抗病毒的侵袭。这与艾春汉等[17]用黄芪处理鲫鱼后，可明显看到其白细胞吞噬活性、血清溶菌酶活性及抗菌活力都显著提高的研究结果较为一致。李俊超等[9]在细胞水平先给药后感染及先感染后给药中都证明板蓝根具有较弱的杀死锦鲤疱疹病毒的作用，有阻止锦鲤疱疹病毒吸附和穿入细胞的作用。黄芪和板蓝根以何种方式阻断Ⅱ型鲤疱疹病毒复制还有待考证。投喂大黄显示异育银鲫死亡率达95%，与对照组死亡率相差不大，但其病毒滴度略低于对照组。刘波等[18]研究结果表明，投喂大黄蒽醌提取物能显著提高建鲤(Cyprinuscarpiovar. jian)的溶菌酶、超氧化物歧化酶活性，提高机体免疫力。投喂大黄试验组对异育银鲫保护效果不佳，推测是大黄在临床使用中的生熟选择以及异育银鲫对大黄蒽醌提取物的吸收水平影响对异育银鲫的免疫效果。大黄蒽醌提取物在水产病害防治中应用广泛，但主要起到抗菌的作用[19]。

3.3 Ⅱ型鲤疱疹病毒感染异育银鲫防控方法

迄今为止，中草药在水产养殖上的实践应用主要有注射、口服和浸泡3种方法。其中使用注射和口服法时，能有效增强呼吸爆发及吞噬活力、白细胞数目等非特异性免疫因素，从而提高机体免疫能力，保护机体免受病原菌的侵害[20]；注射法效果明显，但是，由于工作强度大，会使鱼体产生强烈的应激反应，不适用于大规模饲养；浸泡法可以应用于大规模饲养，但作用时间短，且受环境影响大[5]。因此本试验采用口服法，来降低对鱼体的刺激。

目前对Ⅱ型鲤疱疹病毒的研究相对较少，主要停留在检测方法的建立，尚无有效治疗鲫造血器官坏死症的药物，多数都是以预防为主。洪徐鹏等[21]提出用漂白粉或高锰酸钾等消毒剂对亲鱼或鱼苗浸泡以预防该病；俞军等[22]将聚六亚甲基胍加入异育银鲫养殖水体中，24 h后进行攻毒，保护率超过60%。聚六亚甲基胍对感染3 d和5 d 后的鲫鱼保护率达 63.33% 以上，表明聚六亚甲基胍对Ⅱ型鲤疱疹病毒引起的疾病有较好的治疗效果。Zhang等[23]使用半数组织培养感染剂量1×107/mL鲤疱疹病毒Ⅱ型灭活疫苗免疫鲫鱼，攻毒后试验结果表明疫苗免疫后机体形成保护率为71.4%。本次试验结果表明，穿心莲作为定制饲料药饵具有一定的抗Ⅱ型鲤疱疹病毒效果，为进一步研究预防及控制Ⅱ型鲤疱疹病毒的传播提供了参考依据。

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