miR-197在结肠癌细胞及组织中表达及其意义

叶维霞 郭建红

（泸州市人民医院消化内科 四川 泸州 646000）

结肠癌是全球常见的消化道恶性肿瘤之一，尽管其临床治疗方案不断提高，但由于缺乏有效的靶向治疗，死亡率仍居高不下[1]。因此，寻找到结肠癌有效的治疗靶点仍是当前的一个研究课题。MicroRNA(miRNA)是为一组内源性的非编码小分子RNA，可在转录后水平上调控基因的表达[2]。近年来多项研究证实miR-197在多种肿瘤中表达异常，与肿瘤的发生发展密切相关[3]。由此，本研究初步检测了miR-197在结肠癌细胞及组织中的表达，为下一步探讨 miR-197在结肠癌中所发挥的生物学功能奠定基础。

1.材料和方法

1.1 主要材料

收集2016年8月至2017年3月我院肛肠科结肠癌手术标本14例，每例包括结肠癌组织及对应癌旁组织（均得到病理诊断证实）。结肠癌细胞株HCT116、SW480、SW620、Lovo购买于上海生命科学研究院细胞库。TRlZOl试剂购自Invitrogen公司，反转录试剂盒购自Vazyme公司，Taqman MicroRNA Assay购自ABI公司。

1.2 研究方法

1.2.1 结肠癌细胞的培养

在结肠癌细胞株HCT116、SW480、SW620、Lovo中加入含10%胎牛血清的1640培养基，至37℃、5% CO2培养箱内培养，每2～3d换液，用0.25胰酶消化传代。

1.2.2 RNA提取及质量检测

按说明书用Trizol法分别提取4组结肠癌细胞株、14例结肠癌及对应癌旁组织中的RNA。采用紫外分光光度仪测定总RNA的纯度和浓度。

1.2.3 荧光定量RT-PCR

取1ugRNA按逆转录说明书将其逆转录为cDNA。按Tapman MicroRNA Assay说明以miR-197和RNU6B作模板，miR-197和RNU6B荧光探针作引物扩增，反应条件为，预变性：95℃10min；变性：95℃ 10s，退火，60℃ 20s，延伸，72℃ 34s，扩增40个循环。采用2-ΔΔCt计算miR-197的相对表达量。所有实验均重复3次，计算平均值。

1.3 miR-197靶基因的初步研究

我们利用生物信息学预测网站TargetScan、Pictar、microRNA.org预测miR-197作用的靶基因，通过取三者交集，预测出miR-197得分较高的靶基因。

1.4 统计学处理

所有试验结果运用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以（±s）表示，采用t检验对数据进行比较，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2.结果

2.1 miR-197在结肠癌细胞株的表达

利用qRT-PCR结果发现miR-197在低转移能力的结直肠癌细胞株HCT116、SW480中的表达高于高转移能力的SW620和Lovo细胞株（P＜0.05），如图1。

图1 miR-197在4种结肠癌细胞株的表达

2.2 miR-197在结肠癌组织中的表达

利用qRT-PCR结果发现miR-197在14例结肠癌组织中，除6号、14号外，有12例在癌旁组织中的表达水平均明显高于相应癌组织，差异有统计学意义（P＜0.05），如图2。

图2 miR-197在结直肠癌组织和相配对正常组织中的表达

2.3 miR-197靶基因的预测

miRNA预测网站对miR-197靶基因预测结果显示，Pictar：99个，TargetScan：140个，microRNA.org：7644个，综合三者的交集，我们取分值较高且有大量研究与肿瘤相关密切的的三个靶基因，即ETF1、SYNGR1、ZIC3作为后续研究对象，如图3。

图3 miRNA预测网站靶基因示意图

3.讨论

结肠癌难以治愈、易出现转移，因此寻找有效的靶基因并探讨其功能，不仅有利于阐明结肠癌发生的分子机理，还能为临床诊治、预后判断提供新的靶点。

miRNA是一类大小约21～25个碱基的非编码微小RNA。研究发现miRNA通过靶向调控原癌基因或抑癌基因，发挥着促癌作用或抑癌作用，参与肿瘤生长、转移、血管生成等多种过程[4]。最近发现miR-197序列在多种物种间有高度保守性，提示它可能存在较强大的生物信息学功能。大量研究也证实了这一点，在肝癌、甲状腺滤泡癌、恶性星形胶质细胞瘤、男性乳腺癌、肺癌的筛查过程中发现肿瘤组织中miR-197的表达显著上调[5]。由此，本课题应用qRT-PCR技术检测了miR-197在结肠癌细胞及组织中的表达情况。结果发现miR-197在低转移能力的结肠癌细胞株HCT116、SW480中的表达高于高转移能力的SW620和Lovo细胞株，同时在14例结肠癌组织中，有12例在癌旁组织中的表达水平均明显高于对应结肠癌组织，只有两例6号、14号的表达情况相反，这可能是个体差异造成的。由此，我们初步得出miR-197很可能参与了结肠癌的发生发展过程，但具体机制尚不清楚。我们通过miRNA预测网站对miR-197靶基因进行预测，结果显示Pictar：99个，TargetScan：140个，microRNA.org：7644个，综合三者的交集，我们选取了分值较高且与肿瘤相关密切的的三个靶基因，即ETF1、SYNGR1、ZIC3作为后续研究对象。

综上所述，本研究初步发现了miR-197在结肠癌细胞及组织中的表达差异，提示它可能在结直肠癌发展过程中作为抑癌基因起作用，通过生物信息学预测它可能是通过靶向调控ETF1、SYNGR1、ZIC3的表达来实现。

[1]Zheng Z X, Zheng R S, Zhang S W, et al. Colorectal cancer incidence and mortality in China, 2010[J]. Asian Pac Cancer Prev, 2014, 15(19): 8455-8460.

[2]Calin GA, Croce CM. MicroRNA signatures in human cancers[J]. Nature Reviews Cancer. 2006, 6(11): 857-866.

[3]Hamada S, Satoh K, Miura S, et al. MiR-197 induces epithelial-mesenchymal transition in pancreatic cancer cells by targeting p120 catenin[J]. J Cell Physiol. 2013, 228(6):1255-1263.

[4]Ai RT,Wu SY, Wen XY, et al. 1,3,4-tri-O-galloyl-6-O-caffeoyl-β-D-glucopyranose, a new anti-proliferative ellagitannin, regulates the expression of microRNAs in HepG(2) cancer cells[J]. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao.2011, 31(10):1641-1648.