耐酸酵母菌株在沙棘果酒中的应用研究

胡佳星，袁文艳，杨小冲，陈忠军*，贾美芳，高 欣，丁鹏泽，张璐瑶

（内蒙古农业大学 食品科学与工程学院，内蒙古 呼和浩特 010018）

沙棘又称醋柳、酸刺，被誉为“二十一世纪的长生果”。在我国沙棘的食用有着悠久的历史，早在公元8世纪《四部医典》中就已出现关于沙棘的记载[1]。沙棘含有上百种的化合物，包括必需氨基酸、维生素、黄酮等多种活性物质[2]。沙棘中还含有较高含量的酚类和抗坏血酸，使沙棘具有较好的抗氧化和免疫功能[3-4]。除此之外，沙棘还可增加心肌细胞收缩率、改善心衰，还可降血压、抗辐射、抗肿瘤、预防心血管疾病等[5-7]。近些年，研究人员发现沙棘及其种子的提取物还具有一定的抗菌功能[8]。马荣山等[9]采用流加发酵的方式，经响应面法优化，将沙棘酿成了果香饱满，酒精度为11.8%vol的沙棘果酒。徐敏等[10]为克服传统果酒发酵时间长、发酵不易控制、风味较差等缺点采用生物降酸的方式，利用乳酸菌联合酵母的发酵方法，制备一种新型的适合大众饮用的沙棘酒。焦扬等[11]发现沙棘果酒对自由基有较强的清除能力，尤其对羟基的清除率最高，可达97.98%。NEGI B等[12]试验结果表明，沙棘酒对氧化应激及高血胆固醇症均可起到一定的保护作用[12]，具有保健功效。虽然我国已将果酒作为酒类发展重点，但与欧美、日本等发达国家相比，我国果酒的生产发展起步较晚，生产工艺技术落后[13]，在菌株的筛选、育种、酿造及陈化工艺等方面与外国均有较大的差距[14]，因此探索沙棘果酒的生产工艺对于果酒的开发具有十分重要的作用。

沙棘果浆自然pH较低，在发酵过程中，由于酵母所产有机酸的不断积累，使得发酵液的酸度进一步增强[15]，酸度的增强不仅会影响酵母的生长繁殖，还会造成果酒酸涩、酒体粗糙等，因此选用在酸性胁迫下酵母细胞仍具备较好的细胞活性及发酵性能的酵母菌株对于沙棘果酒的生产极为重要。以沙棘为实验原料，将实验室保藏的能够在pH1.8条件下存活的耐酸酵母菌株YM1-1E[16]作为发酵菌株，以感官评分及酒精度为评价指标，采用单因素及正交试验对沙棘果酒的发酵工艺进行了研究，以期得到酒体醇厚、口感细腻、酒精度高、果香浓郁的沙棘果酒，为沙棘果酒的产业化开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

耐酸酵母菌株YM1-1E：本实验室保藏；沙棘原浆：家乐福超市；柠檬酸钠、柠檬酸（均为食品级）：大自然生物集团有限公司；蔗糖：市售；偏重亚硫酸钾（分析纯）：天津大茂试剂厂。

1.2 仪器与设备

PB-10精密电子pH计：德国Sartorius公司；SE602F电子天平：奥豪斯仪器上海有限公司；PAL-1糖度仪：日本TOKOY ATAGO公司；HZQ-F100恒温振荡培养箱；太仓市实验设备厂；LRH-500F生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；WZB数显折光仪：上海仪电物理光学仪器有限公司；SW-CJ-2FD双人单面垂直净化工作台：济南来保医疗器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 沙棘果酒的工艺流程

沙棘原浆→调整成分（添加蔗糖将沙棘配料的糖度调整为23°Bx；以偏重亚硫酸的形式调整沙棘配料中SO2的质量浓度）→接种（菌株YM1-1E活化，制备菌悬液）→恒温120 r/min振荡发酵→12℃陈酿90 d→过滤澄清（通过低温，同时添加皂土澄清剂进行澄清）→沙棘果酒

1.3.2 菌株的活化

将斜面保藏的YM1-1E菌株在无菌环境中接种于酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液体培养基中，28℃恒温培养48 h后，将其以2%的接种量接种到YPD液体培养基中，并在28℃的条件下培养48 h，根据以上操作再次进行传代培养，以下实验均使用第3代菌液。

1.3.3 制备菌悬液

将10 mL三代菌液在4 000 r/min的条件下离心3 min后倒掉上清液，并用无菌生理盐水将离心的菌泥进行洗涤，用漩涡仪混合均匀后，依据平板菌落计数的方法，将活菌浓度调整为1×108CFU/mL。

1.3.4 沙棘果酒的生产工艺的优化

（1）沙棘与水配比：在接种量为3%，初始pH值为3.5，SO2添加量为60 mg/L的条件下，将沙棘与水按照1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12的体积比进行配制，在24 ℃条件下恒温发酵10 d，以酒精度和感官评定为考察指标，分析沙棘与水的比例对沙棘果酒品质的影响。

（2）SO2添加量：在初始pH为3.5，接种量为3%，料水比为最佳的条件下，调整SO（2偏重亚硫酸）添加量分别为30 mg/L、60 mg/L、90 mg/L、120 mg/L、150 mg/L，于24 ℃条件下发酵10 d，以酒精度和感官评定为考察指标，分析SO2添加量对沙棘果酒品质的影响。

（3）初始pH：采用最佳的SO2添加量、料水比，接种量为3%，用柠檬酸和柠檬酸钠将初始pH分别调为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，接种后于24℃条件下恒温发酵10 d，以酒精度和感官评定为考察指标，分析初始pH对沙棘果酒发酵的影响。

（4）接种量：在初始pH、SO2添加量及料水比均为最佳的基础上，按照沙棘配料体积分数的1%、2%、3%、4%、5%的接种量分别进行接种[17]，24℃恒温发酵10 d后，以酒精度和感官评定为考察指标，分析接种量对沙棘果酒发酵的影响。

（5）发酵温度：在料水比、接种量、初始pH以及SO2添加量均为上述试验最佳的条件下，将沙棘配料分别放在20℃、22℃、24℃、26℃、28℃的温度条件下恒温发酵10d，以酒精度和感官评定为考察指标，分析发酵温度对沙棘果酒发酵的影响。

（6）发酵时间：采用已确定的接种量、配料初始pH、料水比及SO2添加量，按照最佳的发酵温度恒温发酵6 d、8 d、10 d、12 d、14 d，以酒精度和感官评定为考察指标，分析发酵时间对沙棘果酒品质的影响。

1.3.5 指标检测方法

感官评定方法：邀请13位实验室成员对发酵后的沙棘果酒进行品尝，以表1为感官评定标准对沙棘果酒进行感官评价，评定分数为100分制，感官评价最终得分为13人评分的平均值。

表1 沙棘果酒感官评定标准Table 1 Sensory evaluation standards of seabuckthorn wine

可溶性浸出物含量：采用数显式折光仪进行检测；残糖含量：使用便携式手持糖度计进行测定；酒精度：依据国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》酒精计法[18]测定；糖醇转化率计算公式如下[19]：

式中：S指糖醇转化率，%；C指酒精度，%vol；G指糖度，°Bx。

1.3.6 数据处理

以上实验均重复3次，实验所得数据均采用Excel软件处理与分析。

2 结果与分析

2.1 沙棘果酒发酵工艺研究单因素试验

2.1.1 沙棘与水的体积比对沙棘果酒品质的影响

图1 沙棘原浆与水的体积比对沙棘果酒品质影响Fig.1 Effect of seabuckthorn pulp to water volume ratio on seabuckthorn wine quality

由图1可知，不同沙棘与水体积比对沙棘果酒品质的影响比较明显，随着沙棘与水体积比的增大，酒精度呈现先增后减的趋势。沙棘原浆浓度过大使得沙棘配料渗透压增大，酵母细胞失水，抑制了细胞的代谢活动，所产果酒酒精度偏低。沙棘原浆与水体积比在1∶6的条件下，发酵的沙棘果酒酒精度与感官评分均达到最大，分别为11.4%vol和82.3分。随着水比例的增大，沙棘原浆中的组分被稀释，原浆浓度降低，导致发酵液中的营养成分无法满足酵母的增殖与发酵需要，因而随着沙棘配料中水比例的增加酒精度逐步递减。所以沙棘原浆与水最佳的体积比为1∶6。

2.1.2 SO2添加量对沙棘果酒品质的影响

图2 SO2添加量对沙棘果酒品质影响Fig.2 Effect of SO2addition on seabuckthorn wine quality

由图2可知，SO2添加量过高或过低均会影响沙棘果酒的品质。适量的SO2能够起到一定的抗氧化作用，避免果酒因氧化而变色，同时还可抑制杂菌的生长，但较低的SO2质量浓度不能有效地抑制杂菌的生长和沙棘果浆的氧化，杂菌对营养物质的消耗及次级代谢产物的分泌，使得沙棘果酒酒精度偏低，风味较差；同时高质量浓度的SO2对会酵母自身的生长及发酵性能产生抑制作用，使沙棘果酒具有刺鼻性气味，影响果酒的风味和口感[20]。当SO2添加量为30～120mg/L时，沙棘果酒酒精度与感官评分均随SO2添加量的增加而增大；当SO2添加量为120 mg/L时，沙棘果酒酒精度与感官评分均达到最大，分别是11%vol和85.0分；当SO2添加量＞120 mg/L之后，沙棘果酒酒精度与感官评分均随之下降。所以沙棘果酒发酵最适宜的SO2添加量为120 mg/L。

2.1.3 初始pH对沙棘果酒品质的影响

图3 初始pH对沙棘果酒品质的影响Fig.3 Effect of initial pH on seabuckthorn wine quality

由图3可知，当初始pH值为3.5～5.5时，随着初始pH增大，酵母生长良好，其发酵性能逐渐提高，酒精度及感官评分呈上升趋势；当初始pH值为5.0时，沙棘果酒酒精度与感官评分均达到最大，分别为11.9%vol和87.5分；当初始pH＞5.0时，沙棘果酒酒体浑浊，色泽变暗，口感变差，酒精度下降，因为过高的pH使沙棘果浆中的部分营养成分变性，破坏了其中的营养物质，果浆颜色变暗，从而降低沙棘果酒的品质，因此选择沙棘配料最佳的初始pH值为5.0。

2.1.4 接种量对沙棘果酒品质的影响

图4 接种量对沙棘果酒品质影响Fig.4 Effect of inoculum on seabuckthorn wine quality

由图4可知，但接种量在1%～3%时，酒精度及感官评分随接种量的增加呈上升趋势；当接种量为3%时，沙棘果酒的感官评分与酒精度均为最高分别为11.7%vol和84.0分。在一定程度上扩大接种量不仅可加速酵母繁殖，还能够提高沙棘果酒的发酵速度。当接种量过大（＞3%）时，沙棘果酒的感官评分与酒精度会随之降低，因为酵母加量过大时发酵液中的营养物质消耗大部分用于酵母的生长繁殖，以致没有足够的糖分可转化为酒精，使酒精度降低。同时过量的酵母还会使果酒出现酵母异味，掩盖沙棘果香，使果酒的口感及风味变差[21]。因此选择沙棘果酒酿造最佳的接种量为3%。

2.1.5 发酵温度对沙棘果酒品质的影响

图5 发酵温度对沙棘果酒品质影响Fig.5 Effect of fermentation temperature on seabuckthorn wine quality

由图5可知，随着发酵温度的升高，沙棘果酒酒精度与感官评分均呈现先上升后下降的趋势。当发酵温度为16℃时，沙棘果酒的感官评分与酒精度均较低，在低温条件下，菌株生长较慢，代谢速率偏低，发酵不足。在发酵温度为24℃时，沙棘果酒的酒精度为11.7%vol，略低于发酵温度为28℃时的葡萄酒，但其口感及风味较好，感官评分较高。随着发酵温度的升高，发酵速率加快，使得酵母过早的衰败导致发酵终止[22]，因此感官品评分呈现下降趋势。当发酵温度控制在24℃时，酿制的沙棘果酒果香饱满、口感柔和，因此选择沙棘果酒最佳的发酵温度为24℃。

2.1.6 发酵时间对沙棘果酒品质的影响

图6 发酵时间对沙棘果酒品质影响Fig.6 Effect of fermentation time on seabuckthorn wine quality

由图6可知，沙棘果酒的酒精度及感官评分伴随着发酵时间在6～10d范围内的延长呈上升趋势；当发酵10d时，所酿沙棘果酒酒体协调、酸甜适中，并且有明显的沙棘果香，酒精度可达11.8%vol；发酵10 d后，发酵停止，此后的沙棘果酒酒精度与感官评分无明显差异，因此选择沙棘果酒最佳发酵时间为10 d。

2.2 发酵工艺优化正交试验

通过对单因素水平试验进行分析，选择对沙棘果酒品质影响较显著的接种量（A）、SO2添加量（B）、发酵温度（C）及初始pH（D）作为影响沙棘果酒发酵的主要因素，固定发酵时间为10 d，沙棘与水的体积比为1∶6，依据试验因素与水平（表2）设计L9（34）正交试验，以沙棘果酒的酒精度及感官评定为评价指标，确定沙棘果酒最佳的发酵工艺。正交试验因素与水平见表2，结果与分析见表3。

表2 发酵工艺优化正交试验因素与水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation technology optimization

表3 发酵工艺优化正交试验结果与分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation technology optimization

由表3可知，当以酒精度为评价指标分析时，对4个因素极差进行比较，极差R的重要次序为：发酵温度＞初始pH＞接种量＞SO2添加量，表明发酵温度对沙棘果酒品质的影响最大。当从感官评定为评价指标进行分析时，由极差R可知各因素对沙棘果酒感官影响次序为：初始pH＞发酵温度＞接种量=SO2添加量，表明初始pH对沙棘果酒品质的影响最大。结果显示沙棘果酒酿造的最优工艺组合为A2B1C3D3，即沙棘与水的体积比为1∶6，酵母菌接种量3.0%，SO2添加量105 mg/L，初始pH 5.3，发酵温度25 ℃发酵10 d。在此最佳发酵条件下进行3次验证试验，得到的沙棘果酒色泽均匀、果香浓郁、口感细腻、有明显的酒香味，酒精度为12.7%vol，残糖为5.6°Bx，糖醇转化率可达48.75%，感官评分为89.0分。

2.3 沙棘果酒质量指标

2.3.1 感官指标

色泽：呈金黄色、色泽均匀、酒体协调、无杂色现象、无沉淀与分层现象；风味：具有沙棘特有的风味，果香饱满浓郁、无异味；口感：醇绵可口、酸甜适中、细腻柔和。

2.3.2 理化指标

酒精度：12.7%vol；残糖含量：5.6°Bx；可溶性固形物含量：18.4%。

2.3.3 卫生指标

细菌总数≤100 CFU/mL；大肠杆菌≤3 MPN/100 mL；致病菌未检出。符合国标GB/T 5009.49—2008《发酵酒及其配制酒卫生标准的分析方法》。

3 结论

本研究以实验室保存的耐酸酵母菌株YM1-1E为试验菌株，将其应用于沙棘果酒的发酵，经单因素及正交试验得到沙棘果酒最佳的生产工艺条件为沙棘与水的体积比为1∶6，发酵温度25℃，酵母菌接种量3.0%，SO2添加量105mg/L，沙棘配料初始pH 5.3，发酵时间10 d。在此优化工艺条件下发酵的沙棘果酒，酒体协调、色泽均匀、果香饱满、口感酸甜，酒精度为12.7%vol，感官评分为89.0分。理化指标与卫生指标均达到国家相关标准要求，对沙棘果酒的研发与生产有一定的参考价值。

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