罗汉果内生菌中产环糊精葡萄糖基转移酶菌株的筛选及产酶条件优化

张昌志，范彩琴，龙楚媚，付 强，赵丰丽，2*

（1.广西师范大学 生命科学学院，广西 桂林 541006；2.珍稀濒危动植物生态与环境保护教育部重点实验室，广西 桂林 541006）

罗汉果（Siraitia grosvenori）是我国特有珍贵药用和甜料植物，为葫芦科多年生藤本植物，主要分布于广西北部山区，具有润肠通便[1]、抗氧化[2]、抗癌[3]、免疫调节[4]、降血糖[5]、止咳祛痰[6]等功效。近年来罗汉果苷IIE、罗汉果苷IIIE、罗汉果苷VI、罗汉果苷V等11种苷成分已在罗汉果的果实中提取获得[7]。罗汉果苷都具有相似的苷元，都以罗汉果醇为苷元骨架，葡萄糖为糖基供体，不同之处在于C3和C24位置上所连的葡萄糖基团的数目和连接方式。李典鹏等[8]利用薄层色谱分析，研究发现苦味的苷IIE、苷III主要存在于果龄30 d果实中，30 d和40 d分别发现了苷III、IV，甜苷V直到70d时才出现且在85d其含量才达到最高，反映出了随着果实的成熟苦苷转化为甜苷。TANG Q等[9]报道，50～70 d甜苷V急剧积累期，果实中调控罗汉果苷元糖基化的二磷酸尿核苷葡萄糖基转移酶（uridinediphosphateglucosyltransferase，UGT）基因表达水平大幅上调，说明罗汉果随着果实的成熟苦苷转化为甜苷的过程中，葡萄糖基转移酶发挥着重要的作用，也说明罗汉果中含有葡萄糖基转移酶。

到目前为止，在世界各地陆续发现了可以产环糊精葡萄糖基转移酶（cyclodextrin glucosyltransferase，CGTase）的菌株，根据采样地点的不同特性一般可分为两种，一种是从极端环境取样，如碱性土壤[10]、沙土[11]、海洋、湖泊[12]、火山、油井等。第二种是从底物富集地取样，从含高浓度淀粉的土壤中分离筛选目的菌株，如玉米[13]、木薯[14]、大豆、土豆、甘蔗、黄豆、南瓜等的种植地[15]以及淀粉工厂原料废物[16-17]。本研究从罗汉果内生菌入手，从中筛选出高产环糊精葡萄糖基转移酶的菌株进行鉴定，在此基础上，采用单因素和正交试验方法对该内生菌的产酶发酵条件进行优化，以期利用CGTase酶法改性罗汉果苦味苷、改变罗汉果苦味皂苷上葡萄糖基团数目、从根本上解决苦果和苦苷的有效利用等问题奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验材料

罗汉果：2015年10月采自广西桂林市龙胜县；编号为ND-3、ND-6、ND-10、NR-1、NR-4菌株均分离自健康罗汉果。

1.1.2 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：称取已去皮马铃薯200 g，切块，煮30 min，四层纱布过滤，加入蔗糖20 g，琼脂20 g，用蒸馏水定容至1 L，pH自然，121℃灭菌25 min。

筛选培养基[18]：可溶性淀粉10 g，蛋白胨5 g，酵母膏5 g，K2HPO40.2 g，MgSO·47H2O 0.2 g，Na2CO30.2 g，酚酞0.3 g，甲基橙0.1 g，琼脂20 g，蒸馏水定容至1 L，自然pH值，121℃灭菌15 min。

种子培养基：可溶性淀粉10 L，蛋白胨5 g，酵母膏5 g，K2HPO40.2 g，MgSO·47H2O 0.2 g，Na2CO30.2 g，水定容至1 L，自然pH值，121℃灭菌15 min。

基础发酵培养基[18]：可溶性淀粉10 g，蛋白胨5 g，酵母膏5 g，K2HPO40.2 g，MgSO·47H2O 0.2 g，Na2CO30.2 g，水定容至1 L，自然pH值，121℃灭菌15 min。

1.1.3 化学试剂

次氯酸钠、无水乙醇（均为分析纯）：西陇化工股份有限公司；酚酞、甲基橙（均为分析纯）：成都市科龙化工试剂厂；马铃薯淀粉（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

BXM-30R型立式压力蒸汽灭菌锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；HZ200LB型恒温摇床、HP400S型生化培养箱：武汉瑞华仪器设备有限责任公司；SY100型显微镜：日本Nikon公司；UV mini-1240型紫外分光光度计：日本岛津公司；Epoch2微孔板分光光度计：美国伯腾仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 罗汉果内生菌的分离纯化

按参考文献[19]中的方法对罗汉果的根、茎、果进行消毒，对已消毒的罗汉果根、茎、果进行剪切后，接种到PDA培养基上，分别置于28℃培养，定期观察生长情况。待组织周围长出菌落后，再进行分离纯化得到罗汉果的内生菌。

1.3.2 产环糊精葡萄糖基转移酶菌株的初筛

将方法1.3.1得到的罗汉果内生菌分别接种于筛选培养基上，培养一段时间后，发现部分菌株在甲基橙和酚酞背景下的平板内出现淡黄色且近无色的斑点，究其原因在于酚酞在环糊精的疏水空腔内会形成无色的二价阴离子[18，20]。挑出有黄色透明圈的菌株于种子培养基中发酵培养，按4%（V/V）接种量接种于装液量为50 mL/250 mL的基础发酵培养基中，于30℃、160 r/min条件下培养72 h。经5 000 r/min离心10 min，上清液即为粗酶液。取200 μL粗酶液滴加至已打孔（d=1 cm）的筛选培养基平板上，40℃水浴2 h，测量黄色透明圈直径大小。挑选出黄色透明圈大的菌株进行复筛。

1.3.3 产环糊精葡萄糖基转移酶菌株的复筛

粗酶液的制备：按照4%接种量将初筛菌株接种于装液量为50mL/250mL的基础发酵培养基中，于30℃、160r/min条件下培养72h。经5000r/min离心10min，上清液为粗酶液。

酶活定义：单位时间内使吸光度值下降10%的酶量定义为一个酶活单位（U/mL）。

酶活的测定[21]：取10 μL适当稀释的初筛菌株的粗酶液，加入0.2 mol/L甘氨酸-NaOH缓冲液（pH 9.0）0.2 mL，再加入0.2%马铃薯淀粉0.2 mL，振荡，于40℃水浴10 min后，立即加入0.5 mol/L的醋酸0.5 mL，终止反应，然后加入0.005%碘液显色。同时以蒸馏水为空白，以不加酶液为对照，在波长700 nm处测定吸光度值。酶活计算公式如下：

式中：a为对照组的吸光度值；b为样品的吸光度值。

1.3.4 环糊精葡萄糖基转移酶产生菌的鉴定

选取复筛中酶活性高且稳定的菌株进行菌种鉴定。

（1）形态学鉴定。将菌株划线于PDA培养基上，37℃培养12～24 h，观察菌落形状、大小、表面光滑度、培养基颜色，并进行革兰氏染色和芽孢染色[22]，观察菌株细胞形态。

（2）分子生物学鉴定。将菌株送武汉华大基因科技有限公司，完成16SrDNA测序，将该菌株的16S rDNA序列在美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）上进行BLAST同源搜索，应用MEGA软件进行序列比对分析，采用邻接法（neighbor-joining，NJ）构建系统发育树。

1.3.5 单因素试验优化产酶条件

对复筛中选取的产酶菌株进行产酶单因素发酵条件研究。基本产酶发酵条件：1%的碳源、0.5%的氮源，pH自然，按4%的接种量将种子液接入装液量为50 mL/250 mL的基础发酵培养基中，于30℃、160 r/min条件下发酵72 h，考察不同单因素对菌株产酶的影响。

碳源种类及添加量的确定：在基本产酶发酵条件下，分别添加1.0%可溶性淀粉、马铃薯淀粉、环糊精、葡萄糖和乳糖代替基础发酵培养基中的碳源，考察碳源对菌株产酶的影响。然后再选择最佳碳源，设置其添加量分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，考察碳源添加量对菌株产酶的影响。

氮源种类及添加量的确定：依据基本产酶发酵条件，在碳源研究的基础上，分别添加0.5%蛋白胨、尿素、干酪素、硫酸铵和柠檬酸铵代替基础发酵培养基中的氮源，考察氮源对菌株产酶的影响。然后再选择最佳氮源，设置其添加量分别为0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%，考察氮源添加量对菌株产酶的影响。

初始pH值的确定：考察初始pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0时对菌株产酶的影响。

发酵温度的确定：考察发酵温度分别为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃时对菌株产酶的影响。

装液量的确定：考察装液量分别为50mL/250mL、70mL/250 mL、90 mL/250 mL、110 mL/250 mL、130 mL/250 mL时对菌株产酶的影响。

1.3.6 正交试验优化产酶条件

在单因素研究的基础上，根据单因素试验结果，固定对试验结果影响不大的因素，选择对试验结果影响大的因素，以CGTase酶活作为评价指标进行产酶条件优化[23-24]。

2 结果与分析

2.1 产环糊精葡萄糖基转移酶菌株的初筛结果

通过初筛从罗汉果内生菌中筛选获得11株CGTase产生菌，部分菌株酚酞甲基橙显色结果如图1所示。从中选出5株褪色明显的内生菌进行复筛，分别在对数期（36 h）和稳定期（72 h）对酶活进行测定，结果见表1。

图1 5株内生菌酚酞甲基橙褪色结果Fig.1 Phenolphthalein methyl orange discoloration results of 5 strains of endophytic bacteria

表1 产CGTase菌株的筛选结果Table 1 Screening results of CGTase-producing strains

由表1可知，在培养36 h进行酶活测定时，不同菌株的酶活力相差较大，但在培养72 h后，测得5株菌株都有较强的酶活。说明菌株在对数期时生长活跃，但产酶较少，产酶主要在稳定期。在72 h时测定菌株ND-6酶活最高为6 831 U/mL，菌株NR-4酶活较低为4 012U/mL；综合考虑产酶活力，选择产CGTase快且酶活高的菌株ND-6进行后续试验。

2.2 菌株ND-6的鉴定

2.2.1 形态学鉴定

菌株ND-6的菌落及细胞形态结果见图2。由图2a可知，在PDA培养基上，菌株ND-6菌落呈圆形，中间皱起，边缘平整，略带黄色。由图2b可知，菌株在光学显微镜下呈杆状，革兰氏染色为阳性，有芽孢且位于菌体中间，初步得出该菌株属于芽孢杆菌。

图2 菌株ND-6的菌落(a)和细胞(b)形态Fig.2 Colony(a)and cell(b)morphology of strain ND-6

2.2.2 分子生物学鉴定

由武汉华大基因科技有限公司测得ND-6的16S rDNA基因序列碱基长度为1 445 bp，经过同源性序列检索，结果显示菌株ND-6与Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus subtilis、Bacillussp.、Bacillus velezensis等的16S rDNA 序列同源性高于99%。在搜索比对结果中选择与菌株ND-6同源性较高的菌株，建立菌株ND-6的系统发育树，结果见图3。由图3可知，菌株ND-6与Bacillus amyloliquefaciens聚于一支，相似度最高。结合菌株ND-6的形态观察结果和分子生物学鉴定结果，参照《常用细菌系统鉴定手册》[25]，最终确定菌株ND-6为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

图3 菌株ND-6基于16S rDNA序列建立的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of strain ND-6 based on 16S rDNA sequences

2.3 单因素试验结果分析

2.3.1 碳源种类及添加量的选择

碳源种类对菌株ND-6产酶的影响结果见图4。由图4可知，环糊精最有利于菌株ND-6产酶，酶活达到6 947 U/mL；可溶性淀粉次之，酶活为6 736 U/mL，乳糖和葡萄糖再次之，酶活分别为6 631 U/mL和6 000 U/mL，马铃薯淀粉也能产酶，但产酶水平远低于前述碳源，酶活只有1 894 U/mL。因此，选择环糊精作为最佳碳源。

环糊精添加量对CGTase酶活影响结果见图5。由图5可知，随着环糊精添加量的增加，CGTase酶活先增加后降低。当环糊精添加量为0.5%～1.0%时，随着环糊精添加量的增加CGTase酶活增大；当环糊精添加量为1.0%时，酶活最高为6 852 U/mL；当环糊精添加量为1.0%～2.5%时酶活呈现下降趋势。因此，选择最佳环糊精添加量为1.0%。

图4 不同碳源对CGTase酶活的影响Fig.4 Effects of different carbon sources on CGTase activity

图5 环糊精添加量对CGTase酶活的影响Fig.5 Effects of cyclodextrin addition on CGTase activity

2.3.2 氮源种类及添加量的选择

氮源种类对菌株ND-6产酶的影响结果见图6。由图6可知，蛋白胨为氮源时，酶活最高为6 736 U/mL，且不同氮源对菌株产酶能力影响不一样，说明氮源的选择对产酶的影响十分重要。因此，选择蛋白胨作为最佳产酶氮源。

图6 不同氮源对CGTase酶活的影响Fig.6 Effects of different nitrogen sources on CGTase activity

不同蛋白胨添加量对CGTase酶活影响结果见图7。由图7可知，CGTase酶活随着蛋白胨添加量的增加先升高后降低。当蛋白胨添加量在0.25%～0.75%时，随着蛋白胨添加量的增加CGTase酶活增大；当蛋白胨添加量在0.75%时，此时酶活最大为6 538 U/mL；当蛋白胨添加量在0.75%～1.25%时，CGTase酶活逐渐降低。因此选择最佳蛋白胨的添加量为0.75%。

图7 蛋白胨添加量对CGTase酶活的影响Fig.7 Effects of peptone addition on CGTase activity

2.3.3 装液量的选择

装液量对菌株ND-6产酶的影响结果见图8，由图8可知，菌株产酶随着装液量的增加酶活呈现先升高后降低的趋势，说明菌株产酶和生长需要一定的氧气，菌株在装液量为70 mL/250 mL时，酶活最高为5 684 U/mL。因此，选择最佳装液量为70 mL/250 mL。

图8 不同装液量对CGTase酶活的影响Fig.8 Effects of different loading volume on CGTase activity

2.3.4 培养基初始pH值的选择

培养基初始pH值对菌株ND-6产酶的影响结果见图9。

图9 不同初始pH值对CGTase酶活的影响Fig.9 Effects of different initial pH value on CGTasee activity

由图9可知，在菌株的发酵过程中，随着培养基的初始pH值增加，CGTase活性先升高后降低，当培养基初始pH值为8.0时，酶活性最高为8 526 U/mL，这说明微碱性环境有利于菌株ND-6产酶。因此，选择培养基最优初始pH值为8.0。

2.3.5 发酵温度的选择

发酵温度对菌株生长及产酶有很大的影响，合适的温度对发酵效率和产酶的积累都很重要。培养温度对菌株ND-6产酶的影响结果见图10。由图10可知，菌株在25～50℃范围内随着温度的增加酶活先升高后降低，产酶适宜范围为40～50℃，且在45℃时具有最高的酶活力，酶活为9263U/mL。说明温度为45℃时，适合菌株产酶。

图10 不同发酵温度对CGTase酶活的影响Fig.10 Effects of different fermentation temperatures on CGTase activity

2.4 正交试验优化菌株ND-6的发酵条件

在单因素试验的基础上，固定装液量为70mL/250mL，选择环糊精（A）、蛋白胨（B）、初始pH值（C）、发酵温度（D）为影响因素，CGTase酶活为考察指标，采用L9（34）正交设计研究不同因素对酶活的影响，正交试验结果与分析见表2，方差分析见表3。

表2 产CGTase发酵条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for optimization of CGTase-producing fermentation conditions

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2、表3可知，在菌株产酶的过程中，各因素对产酶的影响程度各不相同。根据极差大小R值得出影响菌株ND-6产酶强弱顺序为D＞A＞B＞C，即初始pH值＞环糊精添加量＞蛋白胨添加量＞发酵温度。由极差分析得出最佳产酶的条件为A2B3C1D2，即最佳培养条件为环糊精1.0%、蛋白胨1.0%、发酵温度40℃、初始pH值8。

2.5 验证试验

利用优化后的培养基和培养条件对菌株ND-6重新发酵产酶，即以蛋白胨10 g，环糊精10 g，酵母提取物5 g，K2HPO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，Na2CO30.2 g，水定容至1 L，配制发酵液，调节初始pH值为8.0，接种量为4%，装液量为70 mL/250 mL，40℃、160 r/min振荡培养72 h，离心制备粗酶液，测得的CGTase酶活为9 753 U/mL。

3 结论

从罗汉果内生菌中筛选出了一株高产葡萄糖基转移酶的菌株ND-6，经形态学和分子生物学鉴定其为一株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。通过单因素和正交试验得出最优产酶发酵条件为环糊精1.0%作碳源、蛋白胨1.0%作氮源、发酵温度40℃、初始pH值8.0，装液量70 mL/250 mL。在此优化发酵条件下，测得发酵液中的CGTase酶活可达9 753 U/mL，CGTase酶活是优化前的1.43倍。

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