采用不同装置培养螺旋藻的对比研究

谯顺彬，董汝晶，张义明*，田 辉

（贵州工业职业技术学院，贵州 贵阳 550008）

螺旋藻（Spirulina）是一类广泛分布于热带、亚热带地区淡水或盐碱性湖泊中的原核微生物，因细胞形态为单细胞或多细胞构成的螺旋形丝状体而得名，属于蓝藻门、蓝藻纲、段殖藻目、颤藻科、螺旋藻属。螺旋藻又称节旋藻、蓝细菌[1]。目前国内外研究较多的为钝顶螺旋藻（Spirulina platensis）和极大螺旋藻（Spirulina maxima）两种。螺旋藻干粉中蛋白质含量达60%～70%，远高于目前动植物食用蛋白含量。细胞中还含有丰富的碳水化合物、藻多糖、不饱和脂肪酸、微量元素及维生素等丰富的营养物质[2]，已被联合国粮农组织推荐为健康食品之一。

目前，螺旋藻规模化生产仍以光合自养为主，由于藻体生长对地域和环境依赖性强，培养产率低，占地面积大，极大地阻碍了其产业的进一步发展。因此近年来国内外研究人员围绕螺旋藻培养方式、培养装置以及功能应用等方面开展了大量研究，使得藻体培养产率、产品品质和应用都得到了提高。在培养方式方面，主要是在光合自养基础上进行混合营养研究。混合营养即通过向培养基中添加适当的有机营养物来改善细胞代谢过程，降低细胞生长对环境的依赖，促进细胞生长，提高产率和品质[3-4]。在培养装置方面，主要是进行类型各异的光生物反应器的研究设计[5-8]。光生物反应器是根据光合生物或具有光和能力的组织而设计的一类装置，除具有普通生物反应器的基本特点外，还需要配置合理的光照系统。在功能开发方面，主要是细胞中藻蓝蛋白、藻多糖、β-胡萝卜素、γ-亚麻酸及微量元素等具有较好的保健功效和药理作用，在调节血糖、血脂，增强免疫力，抗辐射、抗衰老、抗疲劳以及防癌抑癌等方面具有重要的价值[9-13]。

本试验采用摇瓶、全自动发酵罐和实验室自制的垂直板式光生物反应器进行螺旋藻培养研究，并对培养结果进行比较，以提高螺旋藻培养产率为目的，为研制一套经济高效、结构简单、便于操作的光生物反应器提供相应的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

钝顶螺旋藻（fachb-350）：中科院武汉水生生物研究所；

基础培养基采用AB培养基：碳酸氢钠13.61 g/L、碳酸钠4.03 g/L、磷酸氢二钾0.50 g/L、硝酸钠2.50 g/L、硫酸钾1.00 g/L、氯化钠1.00 g/L、硫酸镁0.20 g/L、氯化钙0.04 g/L、维生素B120.15 μg/L、PIV金属溶液5.00 mL、A5微量元素溶液1.00 mL、蒸馏水993 mL。

葡萄糖、硝酸铵、维生素B1、维生素B12、精氨酸、萘乙酸、氢氧化钠、3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、丙酮、酒精等试剂（均为AR级）：国药集团化学试剂公司。

1.2 仪器与设备

ZWYR-240恒温摇床：上海智城分析仪器制造有限公司；BiostatC全自动发酵罐：德国B.BraunBiotechInternational公司；光生物反应器：由课题组设计，采用垂直板式结构，其长×宽×高分别为320mm×80mm×390mm，容积约10.0L。

1.3 试验方法

1.3.1 接种量试验研究

采用摇瓶培养：新鲜藻泥经多层无菌纱布过滤后，并用无菌水反复冲洗，按照0.06g/L、0.08g/L、0.1g/L、0.12g/L、0.14 g/L、0.16 g/L、0.18 g/L、0.2 g/L不同质量浓度分别接种到装有150 mL新鲜培养基的250 mL摇瓶中，温度控制（30±1）℃，转速120 r/min，光照强度3.5～4.0 klx，培养7 d后分别测定各接种浓度的平均比生长速率（μ），每个浓度做3个平行取平均值。

1.3.2 光合自养条件下试验研究

确定接种量后，在光合自养条件下，分别利用上述3种培养装置进行螺旋藻培养，对比不同装置中藻体细胞的生长情况。

摇瓶试验：AB培养基灭菌冷却后接入150 mL至无菌摇瓶中，摇床培养。转速调节为120 r/min，光照强度为（4.0±0.3）klx，温度维持在（30±1）℃、初始pH 9.50±0.01，连续光照条件下培养12 d。

全自动发酵罐试验：AB培养基灭菌冷却后装罐，装液系数0.8，反应器外壁处光照强度为（4.0±0.3）k1x，通气搅拌转速为120 r/min，连续光照培养12 d。

光生物反应器试验：灭菌后的AB培养基接入光生物反应器中，装液系数0.8，反应器外壁处光照强度为（4.0±0.5）k1x，温度维持在（30±1）℃，初始pH9.50±0.01，控制通气量为210 L/h，连续光照下培养12 d。培养过程中每天定时测定藻体生物量和培养液pH，并定时补加相同温度的无菌水保持装液系数恒定。

1.3.3 混合营养条件下试验研究

根据前期试验结果[14]，混合营养条件下试验采用优化培养基。即将AB培养基中碳酸氢钠、硝酸钠两组分分别调整为10、3.5g/L，并依次加入葡萄糖1.242 g/L、硝酸铵0.248 g/L及维生素B10.264 mg/L，其余组分和条件与光合自养培养时相同。

1.3.4 测定方法

藻体生物量的测定：采用干质量法[15]。

藻体生物量以藻体干质量（dry mass，DM）计算。接种后取培养液20 mL于已烘干至质量恒定（干燥温度85℃）的纸片抽滤，无菌水冲洗两次，同温度下再次烘干至质量恒定，用精密电子天平称量，按下式计算干质量（DM）。

式中：M1为抽滤前纸片烘干质量，g；M2为抽滤后纸片烘干质量，g。

培养过程中，按上述步骤每间隔24 h取样抽滤，计算最终藻体生物量。

pH测定：用pH-3C数字式酸度计测定培养液的pH；光照强度测定：用LX-101数字光度表来测定光照强度；藻体细胞形态检测：用ECLIPSE-E200显微镜观察细胞形态和可能的染菌情况，并采用平板涂布的方法进行进一步的检查。

2 结果与分析

2.1 接种量对藻体细胞比生长速率的影响

接种量对藻体细胞比生长速率影响的变化趋势见图1。由图1可知，接种量对细胞生长繁殖影响较大，其比生长速率呈现先升后降的变化趋势，当接种量＜0.1 g/L时，比生长速率呈上升趋势，而＞0.1 g/L时逐渐下降，接种量0.1 g/L时可获得最大比生长速率0.142 h-1。因此，在接下来的试验中均采用0.1 g/L的新鲜藻泥进行接种培养。

图1 接种量对细胞比生长速率的影响Fig.1 Effect of inoculum on the specific growth rate of S.platensiscell

2.2 光合自养培养螺旋藻对比试验

光合自养条件下藻体细胞在3种装置中的生长趋势见图2。由图2可知，在光合自养条件下，3种装置均能满足藻体细胞的生长需求。藻体细胞在摇瓶和全自动发酵罐中生长缓慢，摇瓶培养至第10天时细胞生物量最大值为0.715 g/L，而全自动发酵罐培养至第12天时为0.789 g/L。相比较于前两种培养装置，藻体细胞在光生物反应器中生长速率更快，培养至第9天时细胞生物量最大值为1.277 g/L，比摇瓶培养最大值提高78.6%，比全自动发酵罐培养结果提高61.8%，且培养时间可缩短1～3 d。

主要原因是光合自养条件下光照强度是细胞生长的主要限制性因素，自制光生物反应器采用垂直板式设计，材质为4.0 mm白色玻璃，比表面积为17.98，两边各安装数根12 W白光源日光灯，与反应器外壁灯距约5 cm。在通气情况下，藻体细胞受光照均匀，细胞生长情况较好，最终培养产率较高。而摇瓶培养时采用水平振动，摇床顶盖安装光源，光距较长且细胞光照不均，细胞生长较缓慢，产率最低。采用全自动发酵罐培养时，由于罐体直径比摇瓶和板式光生物反应器大，细胞间存在屏蔽效应，且藻体细胞受光照时间和通气搅拌转速影响，搅拌过慢细胞机械损伤小，光照时间短细胞生长较慢，搅拌过快则叶轮对细胞剪切力增加，导致细胞破坏严重，故在发酵罐中培养时只能选择适合的搅拌转速。

图2 光合自养条件下藻体在3种装置中的生长曲线Fig.2 Growth curves ofS.platensisunder the condition of photoautotrophy in the three devices

2.3 混合营养培养螺旋藻对比试验

螺旋藻在混合营养条件下采用3种培养装置进行培养的生长情况见图3。由图3可知，与光合自养相比，混合营养条件下3种培养装置中藻体细胞生长速率均有大幅提升，且3种装置中细胞生长趋势与光合自养条件下情况相似。光生物反应器培养9 d后藻体生物量最大值为1.715 g/L，摇瓶培养至10 d后藻体生物量为1.613 g/L，而全自动发酵罐培养12 d后藻体生物量为1.616 g/L，光生物反应器中细胞生物量分别比摇瓶和全自动发酵罐培养时提高6.3%和6.1%。同时，3种装置中藻体生物量最大值分别比光合自养条件下提高125.6%、104.8%、34.3%。

在混合营养条件下，由于添加了葡萄糖和其他有机营养成分，不仅为细胞生长提供了一定的能源，而且对细胞生长有调节功能，有利于降低细胞生长对光照的依赖。在培养前期藻体细胞主要进行异养生长，待添加的葡萄糖消耗殆尽时，细胞才逐步开始转为光合自养生长。

图3 混合营养条件下藻体在3种装置中的生长曲线Fig.3 Growth curves ofS.platensisunder the conditions of mixotrophy in the three devices

2.4 细胞形态及染菌情况观察

在光合自养和混合营养两种条件下，分别对细胞形态及染菌情况进行观察，结果见图4。

图4 在光合自养和混合营养两种培养条件下藻体细胞形态Fig.4 Cell morphology ofS.platensisunder the conditions of photoautotrophy and mixotrophy

由图4可知，无论是光合自养还是混合营养，由于藻体细胞一直处于较高的pH范围（9.50～11.50），多数杂菌仍然难以生长，尽管光生物反应器采用开放式培养，仍未检测到细胞染菌情况，说明后期试验可以继续采用开放式培养。在光合自养条件下，细胞生长速率低，衰亡细胞少，细胞中色素以叶绿素为主，培养液颜色呈深绿色。在混合营养条件下，细胞转为异养为主，细胞生长速率加快，衰亡细胞较多，光合作用降低，细胞中叶黄素含量增加，导致细胞颜色呈黄绿色，且在反应器底部有少量衰亡细胞聚集。此外，与全自动发酵罐相比，摇瓶和光生物反应器中藻体细胞均未受到机械搅拌损伤，藻体细胞更长，形态更完整，而全自动发酵罐中细胞断裂明显。

2.5 光合自养培养藻液pH变化趋势

在光合自养条件下，培养基中的碳酸根离子与碳酸氢根离子是一组缓冲体系，两者含量变化导致pH改变是一个动态过程，随着培养基中无机碳源不断消耗导致培养液pH不断上升。因此，培养液pH的变化趋势在一定程度上可反映培养基中无机碳源消耗的情况。光合自养条件下3种培养装置中培养液pH的变化趋势见图5。由图5可知，摇瓶和全自动发酵罐中培养液pH上升趋势基本一致，培养12 d后pH均超过11.0，而光生物反应器中培养液pH最终为10.27，明显低于前两种装置，尤其是培养5 d后pH上升较慢，其原因是光生物反应器为开放式培养，培养过程中除部分水分蒸发外，当空气泡上升到液面爆裂时，培养液中少量无机盐会溅到反应器内壁，导致培养基无机成分浓度降低，而每天补加的无菌水进一步增加了培养液稀释作用，故光生物反应器中培养液pH较低，且后期变化平缓。

图5 光合自养条件下螺旋藻培养液pH变化情况Fig.5 Change of pH value ofS.platensisculture solution under the condition of photoautotrophy in the three devices

3 结论

本试验采用摇瓶、全自动发酵罐和自制光生物反应器，3种不同装置进行螺旋藻培养研究。研究结果表明，采用质量浓度为0.1 g/L的新鲜藻泥接种时可获得最大生长速率。在光合自养条件下，摇瓶、全自动发酵罐和光生物反应器3种装置中藻体生物量最大值分别为0.715 g/L、0.789 g/L、1.277 g/L，光生物反应器培养产率比摇瓶培养提高78.6%，比全自动发酵罐培养结果提高61.8%，且培养时间缩短1～3 d。采用混合营养培养时，上述3种装置获得的藻体生物量最大值依次为1.613 g/L、1.616 g/L、1.715 g/L，分别比光合自养条件下藻体生物量提高125.6%、104.8%、34.3%。两种条件下自制的光生物反应器均获得了最大的培养产率，尽管混合营养培养的藻体细胞品质比光合自养条件下略差，但未发现染菌迹象，且培养产率得到了较大提高，说明自制的光生物反应器具有一定的实用性，为其他研究者从事螺旋藻混合营养研究提供了一定的依据。

但在培养过程中，由于光生物反应器为开放式培养，飞溅到反应器器壁的营养物质有导致染菌的风险，且每天补加无菌水会造成短时内培养基中各成分浓度下降，影响细胞生长。因此，在今后的研究中，本课题组一方面将继续使用该反应器进行混合营养培养基成分优化及培养方式的研究，另一方面对培养液中无机盐的消耗速率进行定时检测，研究无机盐的补加方式，以期能开发出一套经济高效、操作简便、环境友好的螺旋藻培养工艺。

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