北京地区南瓜病毒病病原种类鉴定

陈利达 曹金强 石延霞 柴阿丽 谢学文李宝聚

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

南瓜（Cucurbita moschata Duch.，中国南瓜）、笋瓜（Cucurbita maxima Duch. ex Lam.，印度南瓜）、西葫芦（Cucurbita pepo L.，美洲南瓜）、墨西哥南瓜（Cucurbita mixta Pangalo）和黑籽南瓜（Cucurbita ficifolia Bouché）并列为世界上南瓜属作物的5个栽培种（李昕升 等，2017）。南瓜因产量高、效益好，且具有一定的保健作用，成为我国北方地区菜粮兼用作物之一。据联合国粮农组织（FAO）统计，2014年全世界南瓜产量约为2 519万t，我国占世界当年总产量的28.74 %，居世界第1位（王璐，2017）。随着南瓜种植规模的扩大，病毒病也愈发严重，成为制约南瓜产业发展的主要因素之一，尤其在高温干旱的年份，严重影响南瓜的品质与产量。据报道，能够侵染南瓜的病毒种类有80多种，其中小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus，WMV）、 南 瓜 花 叶 病 毒（Squash mosaic virus，SqMV）、番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）和马铃薯Y病毒（Potato viurs Y，PVY）（Lecoq et al.，1997；Fletcher et al.，2000；周贤，2013；刘嘉峪 等，2017）发生相对普遍。

近年来北京地区南瓜的种植面积逐年增加，南瓜病毒病危害日趋严重，本文针对北京周边地区采集的疑似感染病毒病的南瓜叶片，采用反转录PCR（RT-PCR）技术进行检测，以期了解北京地区南瓜上主要病毒种类及其分布，为当地南瓜病毒病的防控和抗病品种的选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2016～2017年，在北京周边地区采集疑似感染病毒病的南瓜样本（叶片）共84份：顺义区32份、昌平区15份、大兴区12份、海淀区25份。所采样品均保存在-80 ℃冰箱备用。

1.2 试剂与仪器

试剂：TRIzol Reagent购自英潍捷基（上海）贸易有限公司；反转录试剂盒FastQuant RT Kit购自天根生物科技（北京）有限公司；2×Taq Mix（MT201）购自博迈德科技（北京）有限公司。

仪器设备：3K15型高速离心机，德国Sigma公司生产；DYY-6C型电泳仪，北京市六一仪器厂生产；移液枪，德国Eppendorf公司生产；Jel Doc 2001型凝胶成像系统、Bio-Rad S1000 PCR仪，美国伯乐公司生产。

1.3 植物总RNA提取

采用TRIzol法提取南瓜叶片总RNA。取100 mg南瓜叶片于液氮中研磨，将0.2 g粉末转入1.5 mL离心管，迅速加入1 mL TRIzol试剂，振荡混匀，室温下静置5 min；4 ℃下12 000 r·min-1离心10 min；将上清液转入1.5 mL离心管，加入0.2 mL氯仿混匀，室温放置5 min；4 ℃下12 000 r·min-1离心10 min；取水相（约400 μL）加入等体积的异丙醇，室温下静置10 min；4 ℃下12 000 r·min-1离心10 min；弃上清液，加入1 mL 75%乙醇洗涤沉淀2次，4 ℃下12 000 r·min-1离心5 min；自然干燥，加入50 μL RNase-Free ddH2O溶解；以健康南瓜叶片总RNA为阴性对照，-80 ℃保存备用。

1.4 南瓜病毒病样本RT-PCR检测

以提取总RNA为模板，用FastQuant RT Kit试剂盒反转录合成病毒的cDNA第一条链。使用已报道的 CMV-F/CMV-R、SqMV-1/SqMV-2、PRSV-F/PRSV-R和PVY-1/PVY-2特异性引物（表1）对不同样本进行RT-PCR扩增，其中ZYMV-1/2和WMV-1/2是根据GenBank已有的病毒外壳蛋白基因（Coat Protein，CP）序列所设计。所用引物均由博迈德科技（北京）有限公司合成。

表1 用于南瓜病毒病分子检测的引物信息

PCR扩 增 体 系：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各 0.5 μL，cDNA模板 1 μL，ddH2O补足至20 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性 4 min；94 ℃变性 30 s，53 ℃退火 30 s，72 ℃延伸45 s，共34个循环；72 ℃补充延伸10 min。扩增结束后，取5 μL PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，使用全自动凝胶成像系统记录结果。PCR产物送至博迈德科技（北京）有限公司进行测序，并利用NCBI序列比对工具BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）程序，根据核酸序列同源性确定病毒种类。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR扩增结果

对采集的84份南瓜病毒病样本（叶片）提取总RNA，利用不同特异性引物进行RT-PCR检测，部分检测结果见图1。待测样品中引物CMV-F/CMV-R可扩增出大小735 bp的条带（图1-a），引物ZYMV-1/ZYMV-2可扩增出大小582 bp的条带（图1-b），引物WMV-1/WMV-2可扩增出大小697 bp的条带（图1-c），阴性对照均未扩增出目的条带。表明在待检样品中能分别测出CMV、ZYMV和WMV，但未检测到SqMV、PRSV、PVY。

图1 南瓜部分样品RT-PCR检测结果

2.2 南瓜主要病毒种类检测结果

对采集的84份南瓜病毒病样本进行PCR检测，其中79份病样检测显示阳性，检出3种病毒分别为CMV、ZYMV和WMV，病毒检出率94.05%。其中CMV检出率最高，可达52.38%；其次为ZYMV，检出率44.01%；WMV检出率14.29%（表2）。因此，CMV在北京地区南瓜上侵染最普遍，为优势病毒种类。

北京不同地区南瓜病毒种类及发生程度有所差异（表2）。在南瓜植株上检出的病毒种类最多的是顺义区和海淀区，检测到3种病毒，这2个地区南瓜病毒病发生最为严重；其次是昌平区和大兴区，分别检测出2种病毒，该地区病毒病危害较轻。

表2 北京地区南瓜病毒种类及分布

2.3 南瓜植株上病毒的复合侵染情况

北京地区84份南瓜病毒病样品中，发现14份病样为2种病毒复合侵染，复合侵染率为16.67%（表3）。其中，北京顺义区南瓜病毒病复合侵染种类为CMV和ZYMV，侵染率为18.75%；海淀区南瓜病毒病复合侵染种类为ZYMV和WMV，侵染率为32.00%，未检出3种病毒复合侵染。

表3 北京地区南瓜病毒复合侵染类型及分布

2.4 北京地区南瓜病毒病田间症状

图2 南瓜病毒病田间发病症状

南瓜病毒病的发生可贯穿植株整个生长发育期，为系统性侵染。北京地区南瓜病毒病主要包括花叶、褪绿和皱缩等症状，经室内分子检测后得知田间病毒种类为CMV、ZYMV和WMV 3种。CMV田间症状（图2-a）：叶片叶绿素分布不均，易出现黄色或淡黄色病斑。严重时叶片变小变脆，出现浅黄色部分斑驳，呈现黄绿分布不均的镶嵌状花叶症状。ZYMV田间症状（图2-b）：叶面出现花叶及斑驳症状，部分叶肉逐渐褪绿黄化，易出现明脉。严重时植株矮化，节间变短，叶缘卷曲形成鸡爪状，并常伴有蕨叶及叶面凹凸起伏症状。WMV田间症状（图2-c）：叶片变小变硬，叶缘部分失绿并伴有斑驳等症状。发病中后期植株表现皱缩矮化、叶片卷曲，发病严重时茎蔓变短，发病组织呈瘤状突起。混合侵染的植株发病症状表现较为复杂，发病较重。CMV和ZYMV复合侵染后植株矮化，叶缘卷曲，叶片颜色变浅，出现蕨叶及叶面不平现象（图2-d）。ZYMV和WMV复合侵染现象广泛存在，其症状在叶片上表现明显，叶片出现褪绿黄化，易形成深浅绿色相间花叶，伴有皱褶卷曲现象。有时叶缘处有斑驳突起，病株生长迟缓，开花结果后病情趋于加重（图2-e）。

3 结论与讨论

病毒病是制约南瓜生产的重要因素之一，随着我国南瓜种植面积逐年增加，病毒病的危害日益加重，给南瓜生产造成严重的经济损失。南瓜病毒病在我国长江地区、内蒙古、新疆、黑龙江等地普遍发生（马英，2017）。不同地区引起南瓜病毒病的毒源种类不尽相同，新疆石河子地区南瓜病毒病毒源种类主要为CMV、ZYMV、WMV、PRSV-W（任琛荣 等，2016）；黑龙江地区南瓜病毒病的毒源种类为CMV和WMV（杨国慧，2003）。本试验结果表明，侵染北京地区南瓜的主要毒源有CMV、ZYMV和WMV 3种，未检测到SqMV、PRSV、PVY等其他病毒，由于病毒分布具有区域性，目前SqMV只在黑龙江南瓜上有相关报道（李凤梅，2002）。其他病毒种类也未检出，可能是由于采样数量少或部分南瓜植株病毒症状表现不明显，导致漏采。在所有检测样品中CMV的检出率较高，可能是由于CMV寄主范围广，可侵染1 000多种单、双子叶植物（王海河 等，2001），且CMV可由60多种蚜虫进行非持久性传播，因此成为北京地区南瓜病毒病优势毒源。此外，本次采集样本共84份，其中有79份病样显示阳性，5份疑似感染南瓜病毒病，但在该样本内未检测到病毒，可能是生理性病害或药害所致。

瓜类病毒复合侵染现象在不同地区均有报道，部分学者对我国瓜类主产区进行病毒种类调查，发现存在多种病毒复合侵染现象，其中以PRSV和WMV组合最为常见，占复合侵染组合的31.25%（尤毅 等，2016）；重庆地区南瓜检测样品中有93.22%的样品受2种以上病毒复合侵染（青玲 等，2010）。本试验中2种病毒复合侵染率为16.67%，可能与连作、传毒媒介、种子与土壤带毒有关。尤其是昆虫传毒，CMV、ZYMV 、WMV均可通过蚜虫进行传播，部分蚜虫可携带多种病毒进行再侵染，导致一种植株上出现2种或2种以上病毒复合侵染现象。也可能与病毒越冬习性有关，如国内学者在重庆地区对南瓜病毒病进行鉴定，发现农田周围葎草上存在7 种病毒，且复合侵染的比例高达80%（青玲 等，2009）。CMV、ZYMV和WMV均为种传病毒（杨国慧，2003），再加上田间管理不当、单一品种种植模式等，成为南瓜病毒病发生严重且存在复合侵染的主要原因。

本试验已检测出北京地区南瓜病毒病的毒源种类主要有CMV、ZYMV和WMV，但受采集数量和地域性的限制，无法涵盖北京地区南瓜病毒所有种类，因此，是否存在其他病毒种类还有待进一步研究。

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