浅谈建立脓毒症动物实验模型的新方法

高 宇，陈 慧，刘艳苓，谢 莹，张佳丽，栾泽柱，陈桂荣

（辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 110033）

脓毒症（sepsis）是指由感染因素所致的全身炎症反应综合征。该病是导致在重症监护病房接受治疗的非心脏病患者死亡的主要原因，其致死率高达28%～47%[1]。脓毒症动物模型是临床上对脓毒症的发病机制和防治方法进行研究所必须的实验品，也是脓毒症研究的难点所在。盲肠结扎穿孔术（cecal ligation perforation，CLP）是临床上制备脓毒症动物模型的金标准。但是，用CLP制备的脓毒症动物模型不能完全复制临床脓毒症。由于脓毒症患者最常见的感染源来自腹腔，故近年来，临床上逐渐尝试将腹腔感染模型作为常用的脓毒症动物模型[2]。目前，建立与临床肠源性脓毒症的发病机制较为接近的动物实验模型已成为医学界研究的新热点。在本次研究中，笔者采用向模型大鼠的腹腔内注射大鼠粪便匀浆的方法建立肠源性脓毒症大鼠模型，以期为脓毒症的研究提供新的参考依据。

1 仪器与方法

1.1 实验仪器及试剂

1.1.1 实验仪器 XW-80A微型涡旋混合仪（由上海沪西分析仪器厂有限公司生产）、AS3120A超声提取器（由天津奥特赛恩斯仪器有限公司生产）、TGL-16C高速离心机（由上海安亭科学仪器厂生产）、Sartorious CP 225D型精密天平（由北京塞多斯仪器系统有限公司生产）、eppendorf可调式移液器（由德国艾本德公司生产）、DCY-24G型氮吹仪（由青岛海科仪器有限公司生产）、ACO-328型电磁式空气压缩机（由广东海利集团有限公司生产）、FJ-200高速分散均质机（由上海标本模型厂生产）。

1.1.2 实验试剂 浓度为95%的乙醇、无水乙醇、脂多糖（LPS）试剂。

1.2 实验动物

从辽宁长生生物技术有限公司购入60只SD大鼠，其合格证号为SCXK（辽）2015-0001。这60只大鼠均为雌性、SPF级大鼠，其体重为180～220 g。

1.3 实验方法

1.3.1 对实验动物进行分组 将这60只SD大鼠采用随机数表法分为6组，分别为模型组1、模型组2、模型组3、模型组4、模型组5和空白组，每组各有10只大鼠。对这6组大鼠依次进行称重和编号。

1.3.2 进行内毒素血症大鼠模型的复制 1）进行粪便匀浆上清液的制备。对这60只SD大鼠进行1周的适应性饲养后，收集其新鲜成形的粪便。对大鼠粪便进行称量后，向其中加入适量的生理盐水，然后将该混合物置于匀浆机中进行充分的研磨，制备成浓度为10%的大鼠粪便匀浆。按3000 转/min的转速对大鼠粪便匀浆进行5 min的离心处理，得到上清液，然后用注射器吸取适量的上清液备用。2）进行大鼠模型的制备。在进行造模前，使1～5组模型组大鼠禁食12 h，然后按1 ml/200 g的剂量向其腹腔内注射浓度为10%的大鼠粪便匀浆上清液。在注射完成后，观察这5组大鼠的体征及表现。这5组大鼠若出现蜷缩、少动、精神萎靡、毛发不荣、寒颤、鼻周有明显血痕等体征，则表示造模成功。将造模成功的大鼠作为本次的研究对象。

1.3.3 进行血液标本的采集 在5组模型组大鼠造模成功10 h后，从这5组模型组大鼠和空白组大鼠的眼眶静脉丛各采集0.5 ml的血液，将其血液标本放入肝素化的Ep管中，按5000 r/min的转速对其血液标本进行10 min的离心处理，得到上清液，然后将上清液放置在-80℃的环境中保存备用。

1.3.4 进行血液标本的处理 精密吸取6组大鼠150 μl的血液，将其血液标本置于容积为2 ml的离心管中，依次向离心管内加入10 μl的内标液异补骨脂素、600 μl的甲醇，然后进行2 min的涡旋，使管内容物充分地混匀。按5000 r/min的转速对离心管内的混合液进行10 min的离心处理，得到上清液，然后用40 ℃的空气流吹干上清液，得到上清液残渣。向上清液残渣中加入100 μl的甲醇进行复溶，对复溶物进行1 min的超声处理、2 min的涡旋，然后用型号为0.45 μm的微孔滤膜对复溶物进行滤过。

1.3.5 进行血液样本的采集和血清LPS水平的测定 在造模完成48 h后，用乙醚对6组大鼠进行麻醉，用无热原的针筒心尖采集其200 μl的血液。向这6组大鼠的血液标本中加入200 μl的抗凝剂，充分混匀后，将其血液标本置于冰水中，进行5 min的低温离心处理（转速为3000 r/min），得到上清液。将大鼠的血液上清液制备成2倍浓度的稀释液，取 0.1 ml的该稀释液，向其中加入0.4 ml的样本处理液后混匀，制成10倍的稀释液。将该稀释液放入70 ℃的水浴箱中加热10 min后取出，再将其放入冰水中进行冷却。取无热原试管，向其中加入0.1 ml的细菌内毒素检查用水、0.1 ml的内毒素标准溶液、0.1 ml的血浆供试品、0.1 ml的鲎试剂溶液，将上述液体混匀后放入37 ℃的水浴箱中温育10 min。在温育结束后，向上述的混合液中加入0.1 ml的显色基质，混匀，对该混合液再次进行6 min的温育，然后向该混合液中依次加入偶氮化试剂1、偶氮化试剂2和偶氮化试剂3（各加入0.5 ml），待混匀后静置5 min，在λ 545 nm处测定该混合液的吸光度值。上述实验中所使用的试管、吸头和保存管均为无热原耗材。

1.3.6 进行血清TNF-α 和IL-6水平的测定 从这6组大鼠的血液标本中取40 μl的血液，向其中依次加入10 μl生物素标记的二抗、50 μl的酶标试剂，在37℃的环境下反应60 min，并洗板5次，再依次向其中加入显色液A、显色液B，在37 ℃的环境下显色15 min，然后向其中加入终止液，在加入后的10 min内测定其OD值，并根据标准曲线方程计算对应样品的浓度。

1.3.7 进行脏器组织的病理观察 迅速对这6组大鼠进行解剖，取其心、肝、脾、肺、肾组织，用生理盐水对这些脏器组织进行漂洗后，置入浓度为10%的福尔马林溶液中进行固定。对这6组大鼠的脏器组织进行苏木素-伊红（HE）染色，在光镜下观察各脏器组织的形态和结构，描述各脏器组织的病理变化情况。从这60只大鼠的心、肝、脾、肺、肾组织中各切去约1 cm3的组织块进行脱水，然后用石蜡进行包埋。将这些组织块切成厚度为5 μm的组织切片，对这些组织切片进行脱蜡，用苏木素-伊红（HE）对其进行常规染色，用中性树胶对其进行封片，然后在显微镜下对其进行观察。

1.4 统计学方法

应用SPFF20.0统计软件对本次研究中的数据进行处理，计量资料用均数±标准差（）表示，采用t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 5组模型组大鼠在造模完成后的临床体征及表现

在向模型组5组大鼠的腹腔内注射完浓度为10%的大鼠粪便匀浆后，有80%的大鼠出现喜欢聚集成堆、行动能力下降、失去攀爬行为、轻微眼迷离、大便溏稀、对声音的敏感度减退、不自主寒颤等表现。在注射完成6 h后，这5组大鼠仅在短时间内分散开，仍没有运动行为，其精神萎靡、眼内分泌物增加、毛发竖起且没有光泽、呼吸加深加快、不自主寒颤加重，严重者甚至出现死亡。这5组大鼠的死亡高峰期主要集中在注射粪便匀浆后的12～48 h之间，在注射完3 d后其不再死亡。在这5组大鼠中，有30%的大鼠在注射完粪便匀浆的数小时后死亡。

2.2 5组模型组大鼠与空白组大鼠血清LPS水平的对比

与空白组大鼠相比，5组模型组大鼠血清LPS的水平均较高，P＜0.01。

2.3 5组模型组大鼠与空白组大鼠血清IL-6和TNF-α水平的对比

在注射大鼠粪便匀浆后，5组模型组大鼠血清IL-6和TNF-α的水平迅速升高，且在注射后的6 h达到高峰，在注射后的48 h逐渐降低至正常水平。与空白组大鼠相比，5组模型组大鼠血清IL-6和TNF-α的水平较高，P＜0.05。详见表2。

表1 5组模型组大鼠与空白组大鼠血清LPS水平的对比（EU/ml， ）

表1 5组模型组大鼠与空白组大鼠血清LPS水平的对比（EU/ml， ）

组别（n=10） LPS水平模型组1 2.15±0.08模型组2 2.36±0.04模型组3 2.45±0.03模型组4 2.19±0.04模型组5 2.28±0.03空白组 0

表2 5组模型组大鼠与空白组大鼠血清IL-6和TNF-α水平的对比 （ ng/ml， ）

表2 5组模型组大鼠与空白组大鼠血清IL-6和TNF-α水平的对比 （ ng/ml， ）

组别（n=10） 时间 IL-6 TNF-α模型组5 注射48 h后 203.8±4.52 101.53±2.30模型组4 注射24 h后 280.6±8.44 151.76±2.42模型组3 注射12 h后 244.4±6.26 130.24±1.49模型组2 注射6 h后 338.4±8.33 181.18±3.24模型组1 注射2 h后 463.8±7.42 279.88±1.69空白组 154.6±7.13 69.65±6.98

2.4 5组模型组大鼠与空白组大鼠脏器组织病理切片的对比

对6组大鼠心、肝、脾、肺、肾的病理切片进行对比后发现，5组模型组大鼠的脾脏受损的程度均较轻，但其心、肝、肺、肾中均发现大量的炎性浸润，其心、肝、肺、肾受损均较为明显。详见图1。

图1 5组模型组大鼠与空白组大鼠脏器组织病理切片的对比

3 讨论

脓毒症是指血液中的细菌或病灶将大量的LPS释放入血液，使血液中LPS的水平超过机体所能承受的上限所引发的一系列病理反应[3-4]。发生烧伤、肠道菌群异位、大面积的严重感染、遭受外伤等均可导致脓毒症发生。近年来，医学界对脓毒症的研究日益广泛。因此，在进行脓毒症的动物实验时选择合适的造模方法，复制与临床上脓毒症的发病机制更为相似的病理模型显得尤为重要[5-6]。

在本次研究中，笔者通过向5组SD大鼠的腹腔内注射浓度为10%的大鼠粪便匀浆，使其发生腹膜感染，从而引发肠道菌群紊乱、异位、内毒素释放入其血液，进而使其出现脓毒症的病理状态。在5组大鼠造模完成48 h后，其血清LPS的水平、血清TNF-α和IL-6的水平均明显高于空白组大鼠。对这5组模型组大鼠脏器的病理切片进行分析的结果显示，其心、肝、肺、肾均受到大量炎性因子的浸润，并出现了明显的损伤。由此可见，本研究中所使用的造模方法较为接近临床肠源性脓毒症的发病机制。而且，该造模方法可显著降低进行脓毒症动物实验研究的成本。

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[2] 汤耀卿,李磊.脓毒症动物模型制作方略及应用[J].中华实验外科杂志,2006,23(12):1433-1434.

[3] Levy MM, Fink MP, Marshall JC. 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference [J].Intensive Care Med,2003,29:530-538.

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[6] 刘清泉.对脓毒症中医病机特点及治法的认识[J].北京中医,2007,26(4):198-200.