响应面法优化烟梗中烟碱提取

张志平，李元清，刘建国，宋丽丽

（1.郑州轻工业学院食品与生物工程学院烟草行业烟草工业生物技术重点实验室，河南郑州 450001；2.浙江中烟工业有限责任公司技术中心，浙江杭州 310024）

0 引言

烟梗是烟叶的重要组成部分，经过梗叶分离后可制得占烟叶质量25%～30%的烟梗，我国每年可生产约70×104t烟梗[1]。目前，烟梗主要被用于制造在卷烟中添加的烟用梗丝和再造烟叶[2]，但由于烟梗自身的特点，在卷烟中使用率并不高，仍有1/3被废弃[3]。烟梗与烟叶中的化学成分基本相同，但含量差异显著[4]，其中烟碱是烟梗中含有的一种生物碱，为二元弱碱，多与柠檬酸或苹果酸形成化合物存在于烟草和烟梗中[5]。烟碱在医药[6-8]、农业[7-9]、化工、烟草工业等领域有较大的应用价值，目前市场中的烟碱产品主要有纯度为40%的硫酸烟碱和95%以上的纯烟碱[10]。国内外对烟碱的提取工艺与应用有较多研究，大部分报道均是采用烟叶作为提取原料[11-12]，而有关烟梗中烟碱的提取工艺鲜有报道。

目前，从烟草中提取烟碱的方法有离子交换法、水蒸气蒸馏法、萃取法等[13]。为了优化烟梗中烟碱的提取工艺，以烟碱提取量为考查指标，以水为提取溶剂，通过水浴时间、水浴温度、溶剂pH值、提取次数、料液比等单因素试验，进一步采用PB试验对试验因素进行筛选，在最陡爬坡试验的基础上，完成中心组合试验（CCD），确定水提取烟梗中烟碱的最佳提取工艺，为烟梗中烟碱的提取提供工艺参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

烟梗，来自福建地区，为2016年长梗；烟碱标准品（Sigma公司，纯度＞99%）；NaOH（AR）、甲醇（SR）、超纯水、磷酸氢二钠（AR）、磷酸（AR）等。

BS201S型分析天平、BCD-275MBC型冰箱、ST-07B型粉碎机、离心机、鼓风干燥机、PHS-3C型pH计、Agilent7820A型高效液相色谱仪、DZKW-4型电热恒温水浴锅等。

1.2 试验方法

1.2.1 原料的预处理

将烟梗去除杂质，放入干燥箱中于105℃条件下干燥至恒质量。

1.2.2 烟碱的提取

准确称取干燥至恒质量的烟梗5 g于250 mL的三角瓶中，加入提取溶剂水，在一定条件下进行水浴提取，然后常规滤纸过滤、定容，取2 mL滤液，以转速12 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL经0.45 μm水系滤膜过滤，然后进行高效液相色谱测定。

1.2.3 烟碱的测定

（1） 标准曲线的绘制。以烟碱标准品为对照，采用高效液相色谱法测定烟碱，色谱条件为色谱柱：Symmetry C18（250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流动相为V1（甲醇）：V2（0.02 mol/L磷酸氢二钠缓冲溶液pH值6.0） =70∶30；检测波长259 nm；流速1.0 mL/min；进样量10 μL；柱温30℃。烟碱质量浓度X与色谱峰面积Y建立回归方程为：Y=13 162X（R2=0.999 6）。

（2）样品中烟碱提取量的测定。取1.2.2中过水系滤膜后的滤液进行液相色谱测定，记录峰面积，根据标准曲线求出滤液中烟碱的质量浓度C，进而求出烟碱的提取量。烟碱的提取量按公式（1）计算。

式中：C——提取液中烟碱的质量浓度，mg/mL；

V——提取液的体积，mL；

m——样品的质量，g。

1.2.4 烟碱提取条件的初步确定

采用单因素试验研究溶剂pH值、水浴温度、水浴时间、料液比对烟碱提取量的影响。按照1.2.2中的提取步骤，分别进行试验测定。

1.2.5 响应面优化烟梗中烟碱的提取条件

（1） 全因子试验设计（DOE）[14]。在单因素试验的基础上进行全因子试验设计，对溶剂pH值、水浴温度、水浴时间、料液比4个因素，以烟碱提取量为响应值进行二水平的试验，筛选对提取率有显著影响的因素。

全因子试验的因素与水平设计见表1。

表1 全因子试验的因素与水平设计

（2）最陡爬坡试验[15]。根据全因子试验的结果，选择显著因素，根据方程的回归系数的符号和大小，设计关于显著因素的最陡爬坡方向与步长，有效逼近最大理想区域。

（3） 中心组合设计[16]。以全因子试验确定的显著因素，结合最陡爬坡确定的最佳试验组合，以该组合为中心点进行响应面分析。

中心组合设计的因素与水平设计见表2。

表2 中心组合设计的因素与水平设计

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 溶剂pH值对烟碱提取量的影响

单因素试验结果见图1。

烟碱的提取量在酸性和碱性条件下均具有较高的提取量，在酸性条件下，烟碱以烟碱盐的形式存在，酸性越强，溶解在水中的烟碱盐越多，在碱性条件下，烟碱盐可解离为游离烟碱，增大溶液的碱性，有利于烟碱盐解离成游离烟碱[4]。由图1（a） 可知，在碱性条件下，随着溶剂pH值的增大而提高，当溶剂pH值超过11后，烟碱的提取量趋于平衡。最佳溶剂pH值为11时烟碱的最大提取量为4.012 mg/g。

2.1.2 水浴温度对烟碱提取量的影响

由图1（b）可知，烟碱提取量随着水浴温度的升高而提高，当水浴温度超过50℃后烟碱的提取量反而下降，因为温度超过一定值后，烟碱和水溶液的互溶效果降低，导致提取量的下降，因此最佳水浴温度为50℃时烟碱的最大提取量为4.101 mg/g。

2.1.3 水浴时间对烟碱提取量的影响

由图1（c） 可知，烟碱的提取量随水浴时间的增加而提高，在1 h后烟碱的提取量趋于平衡，根据固液传质理论，在提取初期，也就是在0～1 h扩散作用居主导地位，固液传质中存在浓度平衡，在1 h之后，烟碱的提取量趋于平衡，因此，最佳水浴时间为1 h时烟碱的最大提取量为4.101 mg/g。时间（C）、料液比4个因素对烟碱提取量的影响，以烟碱提取量为响应值。

图1 单因素试验结果

全因子试验设计结果见表3。

表3 全因子试验设计结果

根据表3中的结果进行回归模型方差分析，得到的回归方程为Y=3.816 8-0.056 7A+0.200 6B+0.167 1C+0.144 1D，其中，p<0.001，R2=0.916 4，因此该模型拟合效果较好。

全因子试验设计的主效应分析见表4。

表4 全因子试验设计的主效应分析

2.1.4 料液比对烟碱提取量的影响

由图1（d）可知，料液比对烟碱提取量有较大的影响，随着料液比的增加，烟碱提取量也逐渐增大。推测原因：随着料液比加大，料液之间的浓度差也逐渐加大，导致烟碱向溶剂中转移。料液比超过1∶25后，烟碱提取量趋于平缓，考虑节约溶剂的因素，选择最佳料液比为1∶25，烟碱提取量为4.348 mg/g。

2.2 响应面优化烟梗中烟碱的提取工艺

2.2.1 全因子试验（DOE） 设计结果

依据单因素试验结果，进行全因子试验（DOE）设计，考查溶剂pH值（A）、水浴温度（B）、水浴

由表4可以得到，对烟碱提取量影响显著的因素分析为水浴温度、水浴时间和料液比。

2.2.2 最陡爬坡试验设计

根据2.2.1得到的回归方程和表3的分析结果设计最陡爬坡的方向和步长，水浴温度、水浴时间、料液比对烟碱提取量的影响显著，而且三者的系数均为正，说明增加三者的水平可以增加烟碱的提取量，以单因素试验的中心点为出发点，设计最陡爬坡试验。

烟碱提取的最陡爬坡试验设计及结果见表5。

2.2.3 中心旋转组合（CCD）试验设计及结果

以最陡爬坡试验的最优值所对应的组合为中心点，进行中心旋转组合设计，共20个试验点。

中心组合试验设计（CCD）结果见表6。

利用Minitab对表中数据做回归分析和拟合优化，得到响应面回归模型为：

表5 烟碱提取的最陡爬坡试验设计及结果

表6 中心组合试验设计（CCD）结果

式中：Y——烟碱提取量。

中心组合试验设计（CCD）方差分析见表7。

由表7可知，模型的F值为8.77，p<0.001，模型极显著，失拟项p值为0.252，失拟项不显著，其R2为0.887 6，响应值的变化有88.76%来源于所选因素，表明方程拟合度较好，因此模型具有实际应用意义。

从表7中可以看出，B，C，D，B2，D2对Y值有显著影响，可见试验因素对烟碱提取量的影响不是简单的线性关系，各因素对烟碱提取量的影响大小顺序为料液比＞水浴温度＞水浴时间。

2.2.4 响应曲面拟合和最佳试验点的确定

为了更直观地观察各因素和各因素间的交互作用，利用Minitab软件做出回归方程中交互项的响应曲面图与等值线图。

水浴温度和水浴时间对烟碱提取量的影响见图2，水浴温度与料液比对烟碱提取量的影响见图3，水浴时间与料液比对烟碱提取量的影响见图4。

表7 中心组合试验设计（CCD）方差分析

图2 水浴温度和水浴时间对烟碱提取量的影响

由图2可知，在料液比不变的前提下，水浴时间一定，随水浴温度的提高，烟碱提取量迅速增大，然后迅速减小；水浴温度一定，随着水浴时间的延长，烟碱的提取量先增加后缓慢降低，说明水浴时间对烟碱提取量的影响比水浴温度大。由图3可知，在水浴时间不变的前提下，水浴温度一定，随着料液比的增大，烟碱的提取量先增加后缓慢降低；料液比一定，随着水浴温度的升高，烟碱的提取量先增加后迅速降低，说明料液比对烟碱提取量的影响比水浴温度大。由图4可知，在水浴温度不变的前提下，料液比一定，随着水浴时间的延长，烟碱的提取量先增加后降低；水浴时间一定，随着料液比的增大，烟碱的提取量先增加后缓慢降低，说明料液比对烟碱提取量的影响比水浴时间大。3个因素对烟碱提取量影响的先后顺序为料液比、水浴时间和水浴温度。

图3 水浴温度与料液比对烟碱提取量的影响

图4 水浴时间与料液比对烟碱提取量的影响

通过中心旋转组合设计对试验进行结果优化，利用Minitab软件求解响应面方程最大值，结果见图5，得出最佳提取工艺为水浴温度52.3℃，水浴时间69.01 min，料液比1∶29.8（g∶mL），溶剂pH值为11。在此条件下得到烟碱的提取量预测值为4.591 1 mg/g。

响应面方程最优组合见图5。

图5 响应面方程最优组合

2.3 验证试验

为检验响应面所得结果的可靠性，采用上述得到的最佳提取工艺组合进行烟梗烟碱成分的提取。考虑到试验的进行，将最佳工艺条件修改为水浴温度 52℃，水浴时间 70 min，料液比 1∶30（g∶mL），pH值11，在此条件下对烟梗中的烟碱进行提取，烟碱的提取量为4.522±0.051 mg/g，与预测值相差仅为1.5%，预测值可靠，说明试验结果与模型符合良好，基于响应面法分析所得的优化提取工艺参数准确可靠，具有实际参考价值。

3 结论

以烟梗为原料，通过单因素试验，系统研究溶剂pH值、水浴时间、水浴温度和料液比对烟梗烟碱提取量的影响。利用Minitab进行全因子试验设计（DOE）、最陡爬坡试验和中心旋转组合设计（CCD），得出水溶剂提取烟梗中烟碱成分的最佳提取工艺为水浴温度52℃，水浴时间70 min，料液比1∶30（g∶mL），溶剂pH值11，在此条件下，烟碱提取量为4.522±0.051 mg/g，与预测值基本相符，因此经响应面优化后的提取条件是可行的。试验为烟梗资源化利用提供了一条途径。

[1]李晓，纪晓楠，姚二民，等.烟用梗丝加工工艺研究进展 [J]．贵州农业科学，2013，41（8）：182-186．

[2]于建军．卷烟工艺学 [M]．北京：中国农业出版社，2009：75-80．

[3]张永良，周晓微，梁萌．烟梗综合利用研究进展 [J]．现代农业科技，2016（8）：232-234．

[4]韩富根．烟草化学 [M]．第2版．北京：中国农业出版社，2010：33-40．

[5]马俊勃．烟碱提取的研究进展 [J]．广东化工，2011，38（10）：72-73．

[6]White H E.Four-week nicotine skin patch treatment effects on cognitive performance in Alzheimer's disease[J].Psychopharmacology，1999 （7）：158-165.

[7]Levin E J.Nicotine-haloperidol interactions and cognitive performance in schizophrenia[J].Neuropsychopharmacology，1996，15 （5）：429-436.

[8]Masato S，Mari S，Hirofumi M.Nicotinic regulation of experience-dependent plasticity in visual cortex[J].Journal of Physiology，Paris，2016 （1/2）：29-36.

[9]刘智.浅析烟碱类杀虫剂及其市场走势 [J].农药市场信息，2017（22）：34-34.

[10]袁菊如，徐国良.烟碱提取方法探讨 [J].江西化工，2013 （2）：12-14.

[11]吴映捷，吕新美，闫兵兵，等.响应面法优化酶辅助提取废弃烟叶中烟碱 [J].山东农业大学学报（自然科学版），2017（2）：203-209.

[12]米尔扎提·麦麦提，尔西丁·买买提，喀日耶姆·艾海提，等.正交试验优化逆三相膜萃取烟碱的工艺研究 [J].新疆医科大学学报，2016（11）：1 436-1 439.

[13]张先海，史丽岩，史景明.烟碱的研究现状 [J].海峡药学，2010，22（11）：16-18.

[14]Deka D，Bhargavi P，Sharma A，et al.Enhancement of cellulase activity from a new strain of bacillus subtilis by medium optimization and analysis with various cellulosic substrates[J].Enzyme Research，2011（5）：151 656-151 662.

[15]顾华杰，孙燕，李良智，等.响应面法优化热水浸提灰树花多糖的工艺研究 [J].食品工业科技，2013（19）：234-238，243.

[16]张霞忠，王丹，董垠红，等.中心组合设计优化超声提取柠檬籽中的柠檬苦素 [J].中成药，2016（7）：1 500-1 504.◇