苯硼酸传感材料在糖类物质传感检测中的应用

赵 涛,王俊平

(食品营养与安全教育部重点实验室,天津市食品营养与安全重点实验室,天津科技大学,天津 300457)

糖类物质是食品主要成分之一,被广泛应用于食品加工过程中,具备重要的生理作用,参与多种生命活动[1]。根据糖类单元的数量,将其分为不同的糖类,如单糖、二糖、三糖、中等大小的寡糖和大分子聚多糖[2]。其中单糖大量存在于水果中,并且作为甜味剂、调味剂、增稠剂应用于食品加工[3];多糖是由糖苷键结合的糖链,常见的多糖如纤维素能够促进消化以及降低血糖和血脂等。糖蛋白是由寡糖和多肽链共价修饰连接而形成的一类重要生理活性物质。在营养价值高的藻类以及菌体(如云芝、香菇、螺旋藻等)和药用价值高的中草药(如枸杞、天门冬以及丹参)中均含有具有生物活性和保健作用的糖蛋白[4-6]。因此,糖类物质的分析检测在食品工业上具备重要的意义。

食品中糖类物质的测定方法主要有旋光法[7]、分光光度法[8]、还原糖滴定法[9]、比色法[10]、酶分析法[11]、色谱法等[12]。这些方法存在操作复杂、耗时长以及灵敏度低等缺点。特别是糖蛋白的分离分析存在丰度低以及基质干扰严重等问题,这些问题阻碍了功能性糖蛋白的开发以及应用[13]。针对糖类物质的分离材料以及糖蛋白的快速检测手段受到了研究者的广泛关注。在近些年的研究中,苯硼酸作为一种糖类亲和试剂受到了广泛的关注,苯硼酸传感材料在大分子糖类物质的分析检测方面具备高效以及高灵敏的优点[14]。

1 苯硼酸的结构特性及研究现状

苯硼酸的糖类亲和性主要依靠硼酸配体与顺二羟基结构之间形成的可逆共价键,图1展示了苯硼酸与含有顺二羟基结构物质识别的过程。当体系中的pH超过苯硼酸配体的pKa(酸离解常数)时,硼酸基团与体系中的羟基络合,形成sp3杂化轨道,呈现四面体结构,这种结构能够特异性的识别糖类的顺二羟基结构,并通过脱水形成五元或者六元环酯。当体系中的pH降低时,硼酸酯之间的共价键通过水解断裂,苯硼酸基团恢复至sp2的平面结构。可逆共价键之间的转换特性赋予了苯硼酸良好的糖类亲和特性以及pH响应特性,可应用于糖类物质的快速分离和检测[15]。

图1 苯硼酸与顺二羟基结构之间的关系Fig.1 Relationship between phenylboronic acid and cis-dihydroxy structure

苯硼酸与顺二羟基结构之间的特异结合能力很早就引起了研究者的关注[16]。早在20世纪30年代,研究者就利用硼酸与顺二羟基之间的特异性识别来研究硼酸与多种糖醇以及酸酐之间的结合以及解离作用[17]。在此后的10年间,研究者关注硼酸在糖类物质的分离以及分析中的应用[18]。在1957年,Foster[19]将硼酸应用区带电泳分离糖类物质。在1958年,Sugihara[20]就开始研究硼酸及其衍生物与不同类型的顺二羟基结构之间的结合力。最早关于硼酸亲和材料报道是1970年Weith[21]利用硼酸修饰的纤维素作为色谱柱固定相来分离糖类以及核酸类。在此之后的30年之间,研究者开发了多种类型的硼酸亲和材料,主要围绕制备硼酸亲和材料的固定相在多种色谱分离手段中的应用。例如薄层色谱[22]、液相色谱[23]以及毛细管色谱[24]。随着组学研究的发展以及深入,特别是蛋白组学和糖组学,研究者开始关注硼酸类亲和材料在大分子分离以及富集上的应用[25],特别是苯硼酸对于多糖、核苷以及糖蛋白中的应用[26-29]。

2 基于苯硼酸的糖类物质传感器

随着学科之间的交叉性越来越强,单一的苯硼酸无法满足高灵敏以及高效检测的需求,研究者开始转向基于苯硼酸的传感器的研究。开发了多种类型的苯硼酸类的传感器,如苯硼酸衍生物的分子传感器、苯硼酸聚合物的传感器、苯硼酸复合型传感材料等。

2.1 苯硼酸衍生物的分子传感器

苯硼酸衍生物分子传感器的代表为苯硼酸荧光探针,根据分子传感器与糖类物质结合方式,主要分成两类,第一类为以共价键与糖类结合的分子传感器,第二类为非共价键连接的分子传感器。

由于苯硼酸能够与顺二羟基结构形成可逆的共价键,苯硼酸可以作为一种理想的糖类接受器。ShiKai作为苯硼酸荧光探针的先驱者,通过不同基团设计制备了一系列苯硼酸荧光探针。1994年,Shinkai[30]报道了探针1作为一种果糖的荧光传感器。Shinkai开创性的在苯硼酸邻位引入甲基以及叔氨基,这种Lewis酸碱的相互作用具备两个优势:一方面,该结构能够降低硼酸基团的pKa,提高探针的识别能力以及在生理条件下的应用能力;另一方面,叔氨基引起了光诱导电荷转移效应(PET),产生荧光猝灭,当探针与糖类结合时,会抑制光诱导电荷转移效应,导致荧光信号增强,这种荧光型号的变化可应用于糖类物质的检测。

尽管该探针1对于单糖具备一定的荧光响应,但是探针1缺乏特异性的识别能力。特别是在生理环境下,探针1对于果糖的响应值要高于葡萄糖。在探针1研究基础上,Shinkai制备了另一种针对葡萄糖的荧光探针2,探针2具备两个苯硼酸基团,两个硼酸基团可以选择性地和其他糖类上的两组邻位羟基反应,具有空间选择性[31]。在进一步研究中,他们制备了化合物3和4(n=3～8)来系统地研究了接头长度的影响(图2),结果表明接头长度为六个亚甲基和七个亚甲基时对D-葡萄糖具有高选择性,而较长的接头对果糖识别更有利[32-33]。

图2 基于氮-硼作用的果糖传感器的化学结构图Fig.2 Chemical structure of fructose sensor 1 and glucose sensors 2 and 3 based on N-B interaction

在以非共价键连接的苯硼酸探针的研究领域,Davis等人[34]合成了多种该类型的探针。合成的探针往往具备一个有效的识别位点,糖类物质与探针在识别位点中通过氢键以及疏水作用力结合。

在最近的研究中,多种类型的苯硼酸荧光探针被开发出来,其中不乏设计惊艳以及功能性强的苯硼酸探针,解决了苯硼酸荧光探针对于葡萄糖特异性识别能力弱以及生理环境下的应用能力差的问题[35-37]。在研究初期,研究者主要关注于单糖,特别是葡萄糖的荧光探针,用于监控血液中葡萄糖的含量[38]。随着研究的深入,针对生物分子中糖类物质如糖蛋白、低聚糖以及核酸的苯硼酸荧光探针越来越受到重视,同时在合成方面,对于合成手段简便以及产率高的苯硼酸荧光探针受到了研究者的青睐[39]。

2.2 苯硼酸聚合物传感器

除了苯硼酸分子传感器,以苯硼酸为聚合单体制备的苯硼酸聚合物也可用作糖类传感材料,通过在聚合物骨架中引入不同功能硼酸基团制备不同类型的聚合物材料,如水凝胶[40]、聚合物胶束[41]、自组装薄膜[42]、多肽[43]以及光子晶体[44]等。与苯硼酸荧光探针不同,苯硼酸聚合物传感器与糖类物质的结合依靠多种作用力。

2.2.1 活性可控自由基技术在苯硼酸聚合物传感器上的应用 随着聚合物合成手段的发展,新型聚合物合成手段,特别是活性可控自由基聚合技术被广泛应用到苯硼酸聚合物的合成。在Xu等人[45]的研究中,他们通过原子转移自由基聚合(ATRP)的方式制备了一种用于分离糖类的材料,在铜催化的条件下,通过 “点击化学” 的方式将荧光性的硼酸基团引入到表面修饰炔基的硅球上。合成的材料在生理条件下与葡萄糖具备较好的荧光响应,同时作者还评价了材料对于大分子糖蛋白的吸附能力。Hogeboom等人[46]报道了一种胶束型糖类传感器,作者通过可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)的方式,制备了形貌规整,粒径分布窄的聚(4-乙烯基苯硼酸)聚合物。通过染料与聚合物材料结合的方式,制备了一种具备pH响应的荧光传感器,该传感器在pH9～10的范围内与葡萄糖具备较好的荧光响应。

2.2.2 水凝胶 硼酸被广泛的应用到水凝胶的改性,修饰硼酸基团的水凝胶与糖类物质结合时,会导致凝胶粒径的改变(溶胀或收缩),这种特性常用于糖类位置的检测以及药物的释放。Braun等人[47]研究了制备了一种对葡萄糖具备体积响应的水凝胶,利用不同类型的氨基苯硼酸对水凝胶修饰,研究氨基苯硼酸取代基的类型以及水凝胶骨架类型对体积响应的影响(图3)。研究结果表明水凝胶体积变化的幅度与氨基苯硼酸的取代基类型有关,取代基为吸电子基团时,会提高水凝胶的响应性能。同时氨基苯硼酸和水凝胶骨架之间的亚甲基接头增多会显著降低了响应幅度。这项研究加深了我们对于氨基苯硼酸功能化水凝胶设计过程的认识。

图3 浓度与聚合物体积变化的关系Fig.3 Concentration-dependent shrinking or swelling of the polymer

2013年,Zhou等人[48]报道了一种染料-微凝胶复合型的荧光葡萄糖传感器。合成的材料中含有硼酸基团和荧光染料波尔多R。波尔多R染料通过与丙烯酰胺凝胶中的酰胺相互作用,导致微凝胶收缩。当向凝胶中加入D-葡萄糖时,聚合物溶胀,改变了凝胶内染料分子的π-π堆积作用,导致凝胶中染料的荧光强度的改变。

在最近的研究中,具备生物响应性的水凝胶在药物传送方面的研究引起了学者的关注。苯硼酸具备pH响应性以及糖类亲和性,通过苯硼酸修饰的聚合物制备具备环境响应性的药物载体。Zhang等人[49]利用2-丙烯酰胺苯硼酸为聚合单体制备了一种响应性水凝胶。合成的水凝胶与葡萄糖结合时会导致粒径降低,同时他们还通过层层自组装的方法制备了一种硼酸修饰的聚乙烯醇的生物材质的水凝胶[50]。

2.2.3 胶束 胶束因具备可控性强、制备简单的优点,在药物释放领域受到了研究的广泛关注。研究者通过在制备过程中加入环境响应性单体,制备多种环境响应性胶束(pH、温度、光照、浓度)。Chen[51]制备了一种具备自我调节功能的胰岛素释放系统。在他们的研究中,通过用3-氨基苯基硼酸(APBA)改性mPEG-b-PGA合成了三种PBA官能化嵌段共聚物。该共聚物可以在生理条件下,自组装形成胶束。胶束与葡萄糖结合时,会导致流体动力学半径(Rh)提高,将胰岛素装载到胶束中,当胶束与葡萄糖结合时会自动释放胰岛素,实现自我调节的功能。

2.3 苯硼酸复合型传感材料

纳米材料具备多种优良的性能,将苯硼酸修饰到纳米材料的表面能够提高材料对于糖类物质的识别能力。纳米多孔材料如金属有机框架[52]、碳纳米管[53]、氧化石墨烯等[54],具备比表面积大、负载能力强等特点。苯硼酸与多孔材料的结合能够有效提高材料的负载能力;纳米荧光材料如量子点[55]、碳量子点[56]、金和银纳米粒子[57-58]、上转换材料[59]等,其荧光特性能够有效地将苯硼酸与糖类物质的结合性能转换为光学信号,降低检测过程的耗时;磁性材料如四氧化三铁,在外加磁场的作用下,苯硼酸修饰的磁性材料能够在实际样品中实现快速富集目标物以及与干扰基质分离[60];温敏材料,如N-异丙基丙烯酰胺,聚(N-异丙基丙烯酰胺)作为一种温度响应材料与苯硼酸的pH响应特性结合,制备双响应传感材料[61-62]。

随着研究的深入,多种功能材料的联用的研究越来越受到研究者的关注。多孔材料与磁性材料的结合,即解决了常规苯硼酸材料负载率低的问题,同时还解决了苯硼酸材料在处理复杂基质中富集与分离的问题[63-64]。Yang 等人[65]制备了一种pH响应性的金属有机框架-磁性四氧化三铁复合材料(图4),制备的材料作为一种糖蛋白的富集材料。

图4 磁性四氧化三铁-金属有机框架复合材料的 制备(A)和复合材料在糖蛋白前处理中的应用(B)Fig.4 Preparation of magnetic ferriferrous oxide-metal organic framework composites(A)and the application of composite materials in glycoprotein pretreatment(B)

苯硼酸荧光探针与多孔材料结合,即保留探针的识别能力,同时还提高了材料的负载能力。Sun[66]利用苯硼酸荧光探针修饰氧化石墨烯,制备一种苯硼酸-氧化石墨烯荧光传感器用于糖类的检测,苯硼酸荧光探针与氧化石墨烯结合导致自身荧光猝灭,当体系中加入果糖时荧光恢复,通过荧光的变化值与果糖浓度之间的关系,实现对果糖荧光检测(图5)。

图5 用于选择性检测单糖的荧光BA@GO传感器Fig.5 Fluorogenic BA@GO sensors for the selective detection of monosaccharides

研究者还利用荧光材料如量子点、碳点、上转换材料与多孔材料结合制备新型荧光传感器。量子点、上转换等无机荧光材料具备性能稳定和易于合成等优点,尽管其灵敏度弱于荧光探针灵敏度,但是已能满足检测的需要。高灵敏度的苯硼酸探针更适用于监控反应以及研究物质的结构与性质。Shen等人[67]利用苯硼酸作为碳源,通过“一步法”制备了苯硼酸修饰的碳量子点,将制备的苯硼酸碳量子点应用于葡萄糖的检测。相对于两步合成法,先合成碳点,再利用苯硼酸修饰碳点。该方法具备简便的特点,避免了修饰过程中复杂的基团设计(图6)。

图6 “一步法” 制备硼酸修饰的碳量子点Fig.6 “One-step” fabrication of boronic acid functionalized carbon quantum dots

双抗体夹心法是酶联免疫法中一种重要的检测方法,特别是在电化学检测上被广泛应用。Ye[68]在双抗体夹心法思路的基础上,利用常规的分子印迹功能单体4-乙烯基苯硼酸以及表面修饰苯硼酸的银纳米粒子模拟双抗体,在表面增强拉曼光谱的基质上,通过表面印迹技术,制备了一种夹心结构的硼酸亲和分子印迹传感材料(图7)。

图7 硼酸亲和型双抗体夹心法的示意图Fig.7 Schematic representation of the boronate-affinity clouble antibody sandwich assay

Zhang等人[69]在量子点CdTe表面制备了一种具备双响应功能的糖蛋白荧光分子印迹传感器,他们首先利用可聚合的表面活性剂十八烷基对乙烯基苄基二甲基氯化铵(OVDAC)修饰CdTe量子点,以pH响应单体4-乙烯基苯硼酸以及温敏单体异丙基丙烯酰胺为分子印迹功能单体,以辣根过氧化物酶为模板,在修饰后的量子点表面合成糖蛋白印迹传感材料,并研究了温度以及pH对合成材料吸附性能的影响。最近,Anzai[70]总结了苯硼酸以及其衍生物在生物电化学传感器上的应用,特别是苯硼酸修饰的金属和玻碳电极应用于葡萄糖/糖蛋白的传感器。此外,作者还提出了苯硼酸修饰电极在氟离子检测方面的应用前景。

3 前景与展望

糖类物质占据了国民饮食结构中很大的比例,合理摄取糖类物质不仅促进健康,还能降低糖尿病、心血管疾病的发生率。糖蛋白作为一种重要的医疗诊断依据,糖蛋白异常表现与众多疾病相关,如感染、肿瘤、心血管病、肝病、肾病、糖尿病等疾病产生与发展相关。因此血液中葡萄糖和糖蛋白含量的实时监控,对于平衡膳食以及合理安排日常饮食具备重要意义。苯硼酸作为一种糖类亲和试剂具备高效、稳定和专一性强的优点。苯硼酸传感材料在血糖监控、药物释控、多糖以及糖蛋白的分析检测方面具备良好的应用前景。

随着新合成技术以及新材料的不断出现,多种功能材料复合型的苯硼酸传感器越来越受到重视。苯硼酸复合型传感器既能结合性能优良的新材料,又能结合灵活多变的新合成技术。在制备高灵敏以及多种多样的糖类物质传感器方面具备广阔的应用前景。

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