巨噬细胞迁移抑制因子及炎症因子在昼夜节律改变小鼠心脏缺血再灌注损伤中的作用

王璐萍 陶潞渊 黄凯宇 宋喜发 张素勤 殷日鹏

研究发现，倒班工作人群的自身昼夜节律受到严重影响[1-3]，而维持正常的昼夜节律是保证心血管系统正常运行的基础[4-7]。Fujino等[8]报道，在日本工厂，倒班人群和固定上白班的人群相比其发生缺血性心脏病的风险显著增加。另有动物实验证实，短时间影响心肌梗死后小鼠昼夜节律，其远期心脏结构将发生改变，导致远期心功能恶化[9]。目前已有研究表明，昼夜节律影响缺血再灌注损伤[10]，但相关的机制研究不多。因此有必要对昼夜节律紊乱和缺血再灌注损伤之间的机制进行进一步探索。目前研究认为，炎症因子是参与心肌缺血再灌注损伤的一个重要因素[11]，局部炎症反应在缺血再灌注损伤中发挥重要作用，被认为是缺血性心肌病不断进展的罪魁祸首。同时已有研究显示，巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）可以有效调控缺血性心肌病心肌炎症细胞因子的释放[12]。

我们的前期研究已证实，4周的黑暗环境暴露能影响小鼠的昼夜节律，并且使小鼠心肌组织MIF的表达下降，因此我们设计此实验，通过检测比较昼夜节律紊乱小鼠及正常节律小鼠缺血再灌注损伤前后心肌MIF、炎症因子表达和心功能等，进一步研究MIF及炎症因子在昼夜节律改变小鼠心脏缺血再灌注损伤中的作用，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 8周龄大的C57BL/6雄性小鼠36只，体质量20～23g（购自上海史莱克实验动物中心），均先在12h光照/黑暗周期环境中[温度（22 ±1°C），光照上午 6：00开始，200～220lux光照强度]饲养2周。本研究所有实验过程均严格遵守中国实验动物福利法并经温州医科大学实验动物使用伦理委员会批准同意。

1.2 仪器和试剂 超声仪（ACUSON Sequoia 512，德国西门子公司），动物心电血压记录仪（美国Labchat公司），MIF单克隆抗体（英国Abcam公司），IL-6（美国RD公司），TNF-α、IL-8单克隆抗体（英国Abcam公司），辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 动物分组 将36只小鼠在12h光照/黑暗周期环境中饲养2周后称重，按体重大小编号，通过随机数字表随机分为4组，每组9只。其中两组继续饲养在12h光照/黑暗周期环境中（正常节律组），另两组饲养在24h持续黑暗的环境中（节律紊乱组），每周清理鼠笼1次，正常节律组小鼠白天清理，节律紊乱组小鼠在微弱红光（1～2lux）下清理，持续4周时间。正常节律组饲养4周后一组行缺血再灌注处理，设为Normal缺血再灌注组，另一组直接行MIF蛋白、炎症因子、心功能等检测，设为为Normal组。节律紊乱组饲养4周后一组也行缺血再灌注处理，设为Disrupted缺血再灌注组，另一组直接行MIF蛋白、炎症因子、心功能等检测，设为Disrupted组。

1.3.2 心脏缺血再灌注 Normal缺血再灌注组及Disrupted缺血再灌注组小鼠均用异氟烷吸入麻醉后，行气管插管，用小鼠呼吸机（Harvard)进行机械通气，用加热板维持小鼠体温37°C，开胸，在左心耳下方2mm处用7-0尼龙线结扎前降支，结扎30min后松开结扎线，逐层关闭胸腔，移除小动物呼吸机，置于电热毯保温，待小鼠麻醉苏醒后继续饲养至原环境中3d。

1.3.3 心脏超声检查 Normal组及Disrupted组小鼠饲养4周后行心超检查，Normal缺血再灌注组及Disrupted缺血再灌注组小鼠缺血再灌注处理后继续饲养3d再行心超检查。在2%异氟烷的吸入麻醉下行经胸心脏超声检查，测左心室舒张末内径（Left Ventricle End Diastolic diameter，LVEDd）、左心室收缩末内径（Left Ventricle End Systolic diameter，LVESd）、左心室射血分数（1eft ventricle ejective fraction，LVEF）、左心室短轴缩短率（left ventricular fraction shortening，LVFS）。所有数据由1位不了解分组且经验丰富的技术人员测量至少3个连续的心脏周期。

1.3.4 HE染色 各组小鼠在超声检查后水合氯醛钠（100mg/kg）腹腔内注射麻醉,经夹捏后爪判断小鼠处于麻醉状态后行颈椎脱臼法处死，取部分心肌组织固定、脱水、石蜡包埋、切片，行HE染色压片，显微镜下观察心脏病理形态以及炎症细胞分布情况。

1.3.5 Western blot法检测 各组取心肌组织各约50mg置于裂解缓冲液中匀浆，裂解心肌组织获取蛋白后，用二喹啉甲酸（BCA）比色法测定蛋白浓度。加入蛋白上样缓冲液，煮沸变性，十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶（SDS－PAGE）电泳，转膜，脱脂奶粉封闭 2～3h，加入一抗 4℃孵育过夜（至少16h），Tris盐酸缓冲液（TBST）洗涤5次，再分别加入二抗稀释液中室温孵育2h，将二抗孵育结束的PVDF膜取出，TBST洗涤5次，增强化学发光法（ECL）发光，曝光仪器中显影，采用AlhaimagerTM2200图像分析系统进行处理，Quantity one 4.0软件进行分析,测定每一个目的条带及内参蛋白（GAPDH）的吸光度值，并分别以MIF、IL-6、TNF-α、IL-8的光密度值与其对应的GAPDH光密度值之比表示其蛋白的表达水平。

1.4 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件，正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 饲养4周后Normal组和Disrupted组小鼠体重心超检查结果和心肌MIF表达变化 经过4周持续黑暗环境暴露后，蛋白印迹显示∶Disrupted组小鼠心肌MIF蛋白的表达较 Normal组小鼠显著降低（a、b）；Disrupted组小鼠和Normal组小鼠体重（c）无差异；Disrupted组小鼠和Normal组小鼠心超检查结果无统计学差异（d-h）。见图1。

图1 饲养4周后Normal组和Disrupted组小鼠体重心功能和心肌MIF表达变化（与Normal组相比，*P＜0.05）

2.2 饲养4周后4组小鼠心脏炎症因子表达的比较 Disrupted 组小鼠心肌 IL-6、TNF-α、IL-8 的表达高于 Normal组小鼠；Disrupted缺血再灌注组心肌IL-6、TNF-α、IL-8的表达显著高于Normal缺血再灌注组，均P＜0.05（a-d）。见图2、3。

由图3可见，HE染色结果显示：Disrupted缺血再灌注组心肌的炎症浸润程度显著高于Normal缺血再灌注组。

2.3 Normal缺血再灌注组与Disrupted缺血再灌注组心功能比较见图4。

由图4可见，和Normal缺血再灌组相比，Disrupted缺血再灌注组心功能受损更严重，LVEDd和LVESd显著增加（均P＜0.05），LVEF和LVFS显著下降（均P＜0.05）。

3 讨论

近年来作息规律差、昼夜颠倒、倒班、晚睡的人群不断增加，这些人的自身昼夜节律已长时间受影响。2012的一项荟萃分析表明，倒班人群的心肌梗死相对风险是1.23，发生心血管事件的相对风险是1.41[13]。PCI目前已成为冠心病主要治疗手段，特别是在急性心肌梗死患者中，急诊PCI是冠脉血管再通的主要手段，能显著降低急性心梗病死率和改善患者心脏功能。但再灌注损伤仍是不可回避的问题，再灌注导致心肌氧自由基增加，钙超载，线粒体膜通透性增加、能量代谢紊乱、加重局部的炎症反应，促进细胞的凋亡[14-15]。

图2 饲养4周后4组小鼠心脏炎症因子表达的比较（与Normal组比较，*P＜0.05；与 Normal缺血再灌注组比较，△P＜0.05；与Disrupted 组比较，▲P＜0.05）

图3 饲养4周后4组小鼠心肌组织病理检查结果比较

图4 Normal缺血再灌注组与Disrupted缺血再灌注组心功能比较（a:M型超声心动图；b-e:LVEDd、LVESd、LVEF、LVFS；与Normal缺血再灌注组比较，*P＜0.05）

炎症反应的加重是心脏缺血再灌注损伤加重的重要原因，伴随着再灌注血流，渗漏的中性粒细胞和促炎因子到达缺血部位[16-17]，炎症因子IL-1β和TNF-α可以直接作用于心肌细胞上，加重心肌损伤[18-19]，TNF-α和IL-6可以诱导炎症细胞分泌可溶性促炎因子C5a、甲酰肽、血小板活化因子[20]。渗漏的中性粒细胞通过弹性蛋白酶、蛋白水解酶、超氧自由基等加重心肌损伤[20-22]。心脏缺血再灌注后，缺血心肌IL-8的水平在再灌注1h后就开始上升，并持续24h至数天，另外，重组的IL-8可以增加中性粒细胞对心肌细胞的黏附性，直接损伤心肌[23]。急性心肌梗死激发区域性和系统性先天免疫反应是心肌愈合过程必不可少的，但区域性的过度炎症反应可增加组织损伤促进心肌细胞死亡[24]。

c-Jun氨基末端激酶（JNK）是丝裂原活化蛋白激酶家族的一员，能控制炎症、增殖、细胞分化与凋亡。JNK主要通过增加Bcl-2家族Bad蛋白的去磷酸化来调控炎症反应及细胞凋亡[24]。目前研究已证实在心肌缺血再灌注损伤中，MIF可以通过上调BAD的磷酸化抑制JNK调节的信号通路，减少心肌梗死面积[25]。用MIF基因敲除的小鼠发现，在心肌缺血再灌注中，MIF的缺失能激活JNK活性增加肌心梗死面积，这一作用能被外源性重组MIF逆转。即使使用茴香霉素激活心肌细胞JNK通路，使其发生磷酸化，JNK的活性仍可以被外源性加入的重组MIF蛋白所抑制[25]。可见MIF在心脏缺血再灌注中具有抗炎抗凋亡作用。

此外，昼夜节律失调影响小鼠免疫组织（胸腺、脾脏、腹腔巨噬细胞）的核心时钟基因节律，导致脂多糖诱导的血液炎症因子水平升高[26]。短期打乱心肌梗死小鼠的昼夜节律，导致其血浆中的IL-6水平和心肌IL-6mRNA的表达情况和正常小鼠相比均发生不同程度的变化[9]。心肌梗死区急性期炎症的反应有利于心肌的存活和修复，然而持续高水平的炎症反应反而损伤心肌增加纤维化，影响心肌的修复[27-29]。

我们用4周时间的黑暗环境暴露来打乱小鼠的昼夜节律，实验结果显示持续黑暗（Disrupted组）小鼠心肌MIF的表达显著下降，同时心肌炎症因子IL-6、TNF-α、IL-8较昼夜交替（Normal组）显著升高，经过缺血再灌注处理后持续黑暗小鼠心脏的炎症因子表达较昼夜交替小鼠缺血再灌注情况下更高。已有研究表明炎症因子是参与心肌缺血再灌注损伤的一个重要因素[19,20]，这和我们的研究结果是一致的。打乱小鼠的昼夜节律使全身免疫功能失调，导致心肌MIF表达的水平下降，同时心肌炎症因子水平增高，心脏缺血再灌注后，MIF抗炎作用下降，增加心肌局部IL-6、TNF-α、IL-8等炎症因子的表达水平，加重的炎症反应增加局部组织损伤促进心肌细胞坏死，使心功能受损加重。

综上所述，我们实验证实了长时间的黑暗环境暴露打乱了小鼠的昼夜节律，并且进一步导致小鼠心脏缺血再灌注损伤加重。其中的机制可能是通过下调心肌局部MIF蛋白的表达，从而增加心脏缺血再灌注后IL-6、TNF-α、IL-8等炎症因子水平，加重心肌局部炎症反应，加重心功能损伤。

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