陆地棉GhDHN1基因结构及内含子生物信息学分析

王俊娟，郭丽雪，陆许可，阴祖军，王德龙，陈修贵，王帅，樊伟丽，陈超，叶武威

（中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室/农业部棉花生物学与遗传育种重点实验室，河南安阳455000）

脱水素是高度亲水性蛋白，在成熟的种子中或在受逆境胁迫的营养组织中大量积累[1]。大量试验证明脱水素基因表达受干旱、低温、高盐等逆境诱导[2-3]。前期研究发现，陆地棉脱水素基因GhDHN1全长726 bp，含有1个90 bp的内含子，响应低温胁迫，在细胞膜附近起作用[4]；其启动子含有多个响应非生物逆境胁迫的顺式作用元件[5]。

内含子是真核生物基因组中的独特成分，在基因演变过程中起着重要的作用[6]。基因的内含子在调控基因表达方面的研究也越来越受到科研人员的重视[7]。本研究在前期研究的基础上，对陆地棉脱水素基因GhDHN1的结构和内含子进行生物信息学分析，旨在揭示棉花脱水素基因响应非生物胁迫的机制。

1 材料与方法

1.1 供试数据库

陆地棉基因组数据库（http://cgp.genomics.org.cn/page/species/index.jsp）[8]和 NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。

1.2 方法

1.2.1脱水素基因GhDHN1内含子序列的获得。在NCBI数据库下载最新的BLAST程序包，将BLAST本地化[9]，同时将所需数据本地化，利用王俊娟等[4]报道的GhDHN1基因组DNA序列和内含子位置，调取其内含子序列。

1.2.2GhDHN1基因及其内含子中AT含量计算。利用DNANMAN 6.0软件计算GhDHN1基因和内含子中各碱基的含量。

1.2.3GhDHN1的内含子中顺式作用元件分析。利用植物顺式作用元件数据库P1antCARE在线启动子 预 测 工 具 （http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）预测GhDHN1内含子中的顺式调控元件。

1.2.4脱水素基因GhDHN1及内含子CpG岛分析。利用在线分析 CpG island finder（http://dbcat.cgm.ntu.edu.tw/）对脱水素基因GhDHN1的基因组DNA序列及其内含子序列进行CpG岛分析。

2 结果与分析

2.1 脱水素基因GhDHN1结构及其内含子序列的获得

利用本地BLAST调取GhDHN1基因的内含子为：GTAAGTACACTAATTCACCTGTCGTTAAATTAATGGGACTTGGTTGTACTATAATTATC-CTAACATGAAATCTGTTGCCTGAACGTGCAG。GhDHN1内含子具有GT-AG规则的保守序列，即内含子5′碱基是GT，3′碱基是AG，推测GhDHN1基因内含子具有保守的剪接机制。

前期试验表明，在该因cDNA的259～348 bp位置上含有1个内含子，其外显子分别位于基因组DNA 的 1～258 bp、349～726 bp[4]；GhDHN1 蛋白的S-片段（包含8个丝氨酸残基）则位于N端的81～88氨基酸残基之间[10]，编码S-片段的核苷酸残基分别位于内含子两侧，具体对应于基因组DNA的位置分别是：编码第1～5个丝氨酸残基的核苷酸残基位于243～257 bp，编码第6个丝氨酸残基的核苷酸残基位于258 bp和349～350 bp，编码第7～8个丝氨酸残基的核苷酸残基位于351～356 bp。

2.2 脱水素基因GhDHN1及其内含子AT含量

利用DNANMAN 6.0软件分析发现，GhDHN1基因组DNA序列中AT碱基含量为52.62%，GC碱基含量为47.38%；GhDHN1基因的内含子序列中AT碱基含量为63.33%，GC碱基含量为36.67%；GhDHN1基因的2个外显子中AT碱基含量分别为48.45%和52.91%。

2.3 脱水素基因GhDHN1内含子顺式作用元件分析

利用在线软件P1antCARE预测脱水素基因内含子中的顺式作用元件，结果显示，GhDHN1基因的内含子中含有6个顺式作用元件（表1），其中正链中含有2个顺式作用元件，分别是光响应的保守DNA模块的部分元件和赤霉素响应元件，说明该内含子可能参与了该基因的转录或调控活动。

2.4 脱水素基因GhDHN1及其内含子的CpG岛分析

CpG岛分析表明，GhDHN1基因的cDNA及内含子的序列上均没有CpG岛，这与其AT含量高的结果相一致。

表1 GhDHN1基因内含子中的顺式作用元件

3 讨论与结论

孙乃恩等[11]研究染色体中富含AT的区段对于基因的转录表达具有重要的调节功能。本研究中，脱水素基因GhDHN1的内含子中AT含量（63.33%）明显高于2个外显子中AT的含量（分别为48.45%和52.91%），且存在1个TATA启动子框的结构，与黄瓜CSHSP70基因的内含子中AT含量相似[12]，推测脱水素基因的内含子可能具有增强该基因转录的作用。

Jiménez-Bremont等[13]系统比较了不同植物脱水素基因内含子特性，发现大多数SKn型脱水素均含有1个内含子，并且此内含子与编码S片段的核苷酸序列有关，这与本研究结果相符合。本研究表明，陆地棉GhDHN 1属于SKn型，其S片段的编码序列也分别位于内含子的两侧，说明棉花脱水素基因的内含子在进化中是相对保守的。

Salgueiro等[14]在基因的内含子中也曾发现启动子结构，对基因的表达起调控作用。本研究结果表明，陆地棉GhDHN1中的1个内含子也存在调控基因表达的重要结构，推测与该基因的功能有关。陆地棉脱水素基因内含子含有多个顺式作用元件，其中含有参与光响应的部分元件、赤霉素响应元件，这与沙冬青脱水素基因AmCIP的内含子所含顺式作用元件部分相似[15]，说明该区域响应激素、光的刺激，可能在增强基因的抗逆性中起到重要调控作用，是对启动子功能的补充。

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