超高效液相色谱-串联质谱快速测定食品中的新品种甜味剂爱德万甜

汪　辉,　黄小贝,　刘　江,　王　柯,　葛　芬

(长沙市食品药品检验所, 湖南 长沙 410016)

爱德万甜(N-{N-[3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)丙基]-L-α-天冬氨酰}-L-苯丙氨酸-1-甲酯)的分子式为C24H30N2O75H2O,为白色粉末,是一种20 000倍蔗糖甜度的超高倍甜味剂[1]。当达到相同的甜度,爱德万甜的用量可以远低于现有市场上的蔗糖和其他高倍甜味剂。欧洲食品安全局和美国食品药品管理局对其做了规定,每日允许摄入量分别为不超过5和32.8 mg/kg·bw[2,3]。国家卫生计生委于2017年10月20日发布第8号公告《关于爱德万甜等6种食品添加剂新品种、食品添加剂环己基氨基磺酸钠(又名甜蜜素)等6种食品添加剂扩大用量和使用范围的公告》[1],正式批准允许爱德万甜作为新品种的食品添加剂添加至部分食品中,同时对相关食品如饮料、发酵乳和果冻等作了限量规定,其限量值比GB 2760-2014《食品添加剂使用标准》中其他甜味剂的限量值低3～4个数量级,即达到痕量级别。目前,食品行业仍存在超限量、超范围使用添加剂的乱象,尤其在不熟悉新品种甜味剂特性且限量值与其他甜味剂相差较大的情况下可能会更加严重。因此,开发测定食品中的爱德万甜高灵敏度的检测方法非常必要且迫在眉睫。

目前,国内外关于爱德万甜的报道较少,关于食品中爱德万甜的检测方法甚少[4,5]。同为食品添加剂的糖精钠、纽甜、甜蜜素和三氯蔗糖等甜味剂因其限量值较高,一般仪器分析方法如高效液相色谱法、气相色谱法的检出限均能达到检测目的[6-8]。爱德万甜由于限量值最低达到了0.4 mg/kg,采用紫外吸收光谱法、高效液相色谱法和气相色谱法已经无法满足其检测需求。因此,本文结合爱德万甜的物理和化学性质,以及液相色谱-串联质谱高灵敏度的特性,通过优化色谱、质谱分析条件、考察基质效应,开发了快速测定食品中爱德万甜的超高效液相色谱-串联质谱法。该方法具有前处理快速、简便易行,灵敏度和准确度高,检测周期短等特点,适用于饮料、酸奶和果冻中爱德万甜的批量检测,可为食品监管和执法提供技术支撑和方法储备,保障消费者健康权益。

1　实验部分

1.1　仪器与试剂

1290型超高效液相色谱-串联6460型三重四极杆质谱(美国Agilent公司), KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司); CT140台式高速离心机(上海天美生化仪器设备工程有限公司); Intergral 3超纯水仪(德国Merck Millipore公司)。

爱德万甜(含量≥97.0%, HPLC级)购于美国SIGMA公司;安赛蜜(1.0 g/L)、赤藓红(1.0 g/L)购于北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司;糖精钠(1.0 g/L)、日落黄(0.5 g/L)、胭脂红(0.5 g/L)购于中国计量科学研究院;苋菜红(0.5 mg/L)、新红(0.5 g/L)购于农业部环境保护科研监测所;苯甲酸(1.005 g/L)、山梨酸(1 g/L)、脱氢乙酸(含量为99.5%)、柠檬黄(含量为96.0%)、诱惑红(含量为97.9%)、亮蓝(含量为80.7%)、靛蓝(含量为90.0%)购于北京曼哈格生物科技有限公司;甜蜜素(含量为99.9%)、阿斯巴甜(含量为96.4%)、对羟基苯甲酸甲酯(含量为99.9%)、对羟基苯甲酸乙酯(含量为99.9%)、对羟基苯甲酸丙酯(含量为99.5%)、对羟基苯甲酸丁酯(含量为99.9%)购于德国Dr Ehrenstorfer公司。

甲醇和乙腈(含量均≥99.9%,色谱纯)购于德国Merck KGaA公司;乙酸铵(含量≥98.0%,分析纯)购于国药集团化学试剂有限公司;冰乙酸(含量≥99.8%,色谱纯)购于天津市化学试剂研究所有限公司;实验用水为超纯水。

1.2　配制标准溶液

精确称取爱德万甜标准品50.00 mg,加入甲醇-水(50∶50, v/v)溶解,定容至100 mL[9],配制成质量浓度为500 mg/L的标准储备溶液。临用时,用空白基质溶液逐级稀释至适当浓度,待测。

取适量安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、柠檬黄、日落黄、胭脂红、苋菜红、诱惑红、新红、赤藓红、亮蓝、靛蓝标准溶液加甲醇-水(50∶50, v/v)稀释,定容至50 mL,配制成1.0 mg/L的标准混合溶液,待测。

1.3　前处理方法

饮料:精确称取1.0 g样品,加入甲醇-水(50∶50, v/v)混匀,定容至10 mL[10],以10 000 r/min的速度离心5 min,上清液过0.22 μm有机滤膜,待测。

酸奶和果冻:精确称取1.0 g样品,加入8 mL甲醇-水(50∶50, v/v)溶液,超声提取10 min,以10 000 r/min的速度离心5 min,取上清液于10 mL容量瓶中,加入甲醇-水(50∶50, v/v)混匀并定容至刻度,溶液过0.22 μm有机滤膜,待测。

1.4　色谱-质谱条件

色谱柱:Agilent SB-C18(150 mm×2.1 mm, 5 μm);进样量:2 μL;柱温:35 ℃;流速:0.4 mL/min;流动相:A相为10 mmol/L乙酸铵溶液,B相为乙腈;流动相梯度洗脱程序:0～1.00 min, 25%B; 1.00～3.00 min, 25%B～75%B; 3.00～5.00 min, 75%B; 5.01 min, 25%B;分析时间:10 min。

电喷雾离子源:正离子电离模式(ESI+);扫描模式:多反应监测(MRM);毛细管电压:4 kV;干燥气(N2)温度:350 ℃;干燥气(N2)流速:10 mL/min;雾化气(N2)压力:3.4×105Pa。爱德万甜母离子为m/z459,裂解电压均为115 V;定性子离子为m/z459>252,碰撞能量为15 eV;定量子离子为m/z459>102,碰撞能量为25 eV。

2　结果与讨论

2.1　色谱条件的优化

爱德万甜为中等极性化合物,采用C18色谱柱分离较合适,所以选用常用的Agilent SB-C18(150 mm×2.1 mm, 5 μm)色谱柱对其进行分离。考察了乙腈-水(50∶50, v/v)和乙腈-0.01 mol/L乙酸铵(50∶50, v/v)两种流动相体系,发现采用后者为流动相体系时,目标化合物的响应低于前者,但后者能够很好地改善峰形,使目标化合物的峰形对称且尖锐。同时对比了乙腈-0.01 mol/L乙酸铵(冰乙酸调pH至6.8)、乙腈-0.01 mol/L乙酸铵(冰乙酸调pH至5.0)、乙腈-0.01 mol/L乙酸铵(冰乙酸调pH至3.0)3种流动相体系,发现保留时间变化甚微,但随着pH值降低,目标化合物响应值显著下降(见图1a)。为确保良好的峰形和较高的响应值,最终选用乙腈-0.01 mol/L乙酸铵(pH=6.8)作为流动相。

图 1 　不同(a)pH和(b)体积比流动相分离爱德万甜的色谱图Fig. 1 　Chromatograms of the advantame using mobile phases with different (a) pH and (b) proportions　　The pH values of acetonitrile-0.01 mol/L ammonium acetate (50∶50, v/v) were 6.8, 5.0, 3.0 for lines 1-3, respectively; acetonitrile-water (50∶50, v/v) for line 4. The volume ratios of acetonitrile-0.01 mol/L ammonium acetate (pH=6.8) were 45∶55, 40∶60, 35∶65, 30∶70, 25∶75 for lines 5-9, respectively; acetonitrile-0.01 mol/L ammonium acetate (pH=6.8) (gradient elution in part 1.4) for line 10.

考察了体积比为45∶55、40∶60、35∶65、30∶70和25∶75的乙腈-0.01 mol/L乙酸铵(pH=6.8)的流动相等度洗脱对目标化合物的分离效果。结果显示:目标化合物的保留时间随着有机相比例降低而延长,峰宽变宽,峰形变钝,响应值随之变小。为得到合适的保留时间和响应值,最终采用体积比为25∶75的乙腈-0.01 mol/L乙酸铵(pH=6.8)流动相进行梯度洗脱(详见1.4节),当乙腈比例达到75%时,得到了峰形窄而尖锐、响应较高的爱德万甜色谱图(见图1b)。

2.2　质谱条件的优化

爱德万甜结构式中有-COOH和-NH-基团,在质谱分析中可能正离子电离模式和负离子电离模式均有一定的响应。取质量浓度为1.0 mg/L的爱德万甜溶液,分别在正离子模式和负离子模式下进行条件优化。采用负离子模式时,目标化合物响应比正离子模式低得多,考虑目标化合物在食品中的限量值较低,决定选用正离子电离模式分析。采用选择离子监测(SIM)模式对母离子[M+H]+(m/z459)进行扫描,优化裂解电压(fragmentor)参数。施加优化好的裂解电压和不同的碰撞能量,采用子离子扫描(product ion scan)模式对子离子进行扫描,得到3个相对丰度较高的特征碎片离子:m/z252、192和102。根据欧盟2002/657/EC规定,质谱分析方法必须不少于4个识别点,选取响应较高的2对多重反应监测(MRM)离子对m/z459>252和459>102分别作为定性和定量离子,其可能裂解途径见图2,并选取优化的碰撞能量参数,以MRM模式对目标化合物进行数据采集。

图 2 　爱德万甜的质谱图和可能的质谱裂解途径Fig. 2 　Mass spectrogram and the proposed fragmen- tation pathways for advantame

2.3　基质效应(ME)评价

基质效应是指样品中被分析物以外的化合物在分析过程中对目标物有显著干扰,并影响结果准确性的现象。由于所测样品基质较复杂,建立的快速测定方法虽然采用甲醇-水(50∶50, v/v)提取溶液可以沉淀部分蛋白质,但未对样品溶液进行净化处理,可能存在一定的基质效应,所以采用基质标准曲线与溶剂标准曲线的斜率百分比来进行评估[11,12]。分别配制质量浓度为0.01、0.02、0.05、0.08、0.10、0.20、0.50、1.0和2.0 mg/L的溶剂(甲醇-水,50∶50, v/v)标准系列溶液、饮料基质标准系列溶液、酸奶基质标准系列溶液、果冻基质标准系列溶液,按优化好的色谱质谱条件测试,根据测试结果建立标准曲线,求得的斜率按公式(1)来计算ME:

ME=a/b×100%

(1)

其中:a为基质标准曲线的斜率;b为溶剂标准曲线的斜率。当ME>100%时,基质存在离子化增强作用;当ME<100%时;基质存在离子化抑制作用。结果表明,饮料、酸奶和果冻的基质效应分别为107.0%、113.4%和105.7%,均存在离子化增强作用。虽然基质效应值在文献报道的85%～115%内,但为了获取更准确的定性、定量结果,本文采用基质标准溶液系列进行分析。分别配制质量浓度为0.01、0.02、0.05、0.08、0.10、0.20、0.50、1.0和2.0 mg/L的爱德万甜基质标准溶液进行线性范围测试。结果显示,饮料、酸奶和果冻在0.01～1.0 mg/L均有良好的线性,相关系数(r2)均大于0.997,线性方程见表1。

表 1 　标准溶液与样品溶液中爱德万甜的线性范围、线性方程、相关系数和基质效应

y: peak area,x: mass concentration, mg/L. /: no data.

2.4　检出限、定量限和线性范围

分别用饮料、酸奶和果冻空白样品按照1.3节前处理方法处理后,分别用3种样品溶液配制10.0 μg/L的基质标准溶液,采用优化好的色谱和质谱条件分析。根据所测样品溶液信噪比S/N≥3和S/N≥10计算检出限和定量限。结果显示,饮料、酸奶和果冻的爱德万甜的方法检出限均为0.03 mg/kg,定量限均为0.10 mg/kg。

2.5　回收率与精密度

分别称取空白饮料、酸奶和果冻各18个样品,每6个一组,分别添加低、中、高3个水平的爱德万甜标准溶液,按1.3节前处理方法进行处理,并进行分析。结果(见表2)显示,测定饮料、酸奶和果冻中爱德万甜的回收率为80.3%～98.0%,相对标准偏差(RSD)为2.0%～7.0%(n=6),符合GB/T 28404-2008《实验室控制规范理化实验室》规定的要求,说明该方法有较好的准确度和精密度。

表 2 　加标饮料、酸奶和果冻中爱德万甜的回收率和相对标准偏差(n=6)

选取3个添加不同浓度标准溶液的酸奶样品进行仪器精密度测试,分别测试6次。结果(见表3)表明,峰面积的RSD为1.83%～5.11%,保留时间的RSD小于0.2%(n=6),峰面积重复性和保留时间重复性均符合JJF 1317-2011《液相色谱-质谱联用仪校准规范》规定的要求,说明仪器有良好的精密度。

表 3 　仪器的精密度测试(n=6)

2.6　干扰实验

根据GB 2760-2014《食品添加剂使用标准》规定,多种食品添加剂被允许添加至饮料、酸奶和果冻中,因此选取实验室现有的甜味剂(安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜)、防腐剂(苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯)和合成着色剂(柠檬黄、日落黄、胭脂红、苋菜红、诱惑红、新红、赤藓红、亮蓝、靛蓝)共20种食品添加剂标准物质配制成1.0 mg/L的标准混合溶液,按1.3节色谱质谱条件测定。结果(见图3)表明,该20种食品添加剂均对爱德万甜的测定无干扰,说明本方法具有良好的抗干扰能力和专一性。

图 3 　干扰试验和实际样品测定Fig. 3 　Interference experiment and determination of the real samples　a. beverage matrix standard solution (0.01 mg/L); b. yogurt matrix standard solution (0.01 mg/L); c. jelly matrix standard solution (0.01 mg/L); d. beverage blank solution; e. yogurt blank solution; f. jelly blank solution; g. 20-standard mixed solution (1.0 mg/L).

2.7　实际样品测定

采用本文建立的方法对市售的6个饮料、6个酸奶和6个果冻样品进行了前处理,并采用超高效液相色谱-串联质谱进行了检测(见图3),均未检出爱德万甜(<0.03 mg/kg),说明目前新品种甜味剂爱德万甜还未在食品行业中广泛应用。

3　结论

本文建立了超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱快速测定食品中新品种甜味剂爱德万甜的方法。以甲醇-水(50∶50, v/v)超声提取样品后,用超高效液相色谱-串联质谱分析检测,并进行了方法学验证和18个实际样品的测定。该方法样品处理简单快速,抗干扰能力良好,准确度和精密度较高,其定量限满足国家标准限量要求,适用于食品中新品种甜味剂爱德万甜的检测,可为食品企业工艺改进和出厂检验进行质量把关,也可为职能部门监管食品中超范围和超限量添加爱德万甜提供技术支撑。