药用植物紫菀组织培养研究

陈 娜，程 磊，孟 肖，姚 洁

亳州职业技术学院药学院,亳州，236800

紫菀为常用中药，具有润肺下气，消痰止咳的作用。2015年版《中国药典》收载其来源为菊科植物紫菀(AstertataricusL.f.)的干燥根和根茎[1]。紫菀根茎呈不规则块状，大小不一，顶端有茎、叶的残基,质稍硬。根茎簇生多数细根，多编成辫状；表面紫红色或灰红色，有纵皱纹，质较柔韧。深入产地调研紫菀仅有亳州、安国两地栽培生产，对紫菀基源形态鉴定发现，两地紫菀同为菊科紫菀属植物，繁殖材料为地下根状茎。由于长期采用根茎繁殖，出现了品种退化、紫菀酮含量达不到药典标准的现象。查阅国内外文献，目前多数学者关注紫菀酮和其他化学成分的研究[2-3]及药理药效方面的研究[4]。关于紫菀组织培养方面的研究未见报道。本文对紫菀的组织培养技术进行研究，以期获得试管苗后进行脱毒培养，改善紫菀品种退化、质量下降的现状。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试亳州地产紫菀采集于亳州职业技术学院药用植物园。所述材料经亳州职业技术学院程磊副教授鉴定，为菊科紫菀属植物紫菀。

1.2 方法

1.2.1 无菌苗的获得

挑选生长健壮无病虫害的带芽根状茎(图1)，截成2 cm左右，去除叶柄残基，流水下冲洗2 h,通过查阅相关文献[5-6]后，分别在75%的酒精和0.1%的升汞中处理(处理时间见表1)，无菌水冲洗4遍后，切去根状茎两端和芽头底端褐化的部分，接入灭菌后的MS培养基，每瓶接种2段，每个处理接种20瓶，培养10 d后，观察统计污染率和死亡率,为了获得大量的无菌苗，本实验重复3次，统计结果取3次的平均值。

表1 紫菀根状茎在升汞和酒精中处理的时间

1.2.2 紫菀试管苗的增殖培养

将获得的无菌侧芽从根状茎上轻轻切下，除去基部的愈伤组织，接入增殖培养基，每瓶接种2棵。增殖培养时以MS为基本培养基，添加蔗糖25 g·L-1、琼脂粉8 g·L-1及不同浓度的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)(见表2)，pH调至5.85，培养14 d后观察增殖情况。

1.2.3 紫菀试管苗的生根培养

选择健壮的试管苗，切去基部的愈伤组织或褐化部分，接入生根培养基,以MS为基本培养基，蔗糖25 g·L-1,琼脂粉8 g·L-1,设置不同的激素浓度(见表3),pH调至5.85,每瓶接种10棵，每个处理接种5瓶，14 d后统计生根情况。

图1 无菌丛芽的获得

编号6-BA/mg·L-1NAA/mg·L-1编号6-BA/mg·L-1NAA/mg·L-111.00.122.00.133.00.141.00.552.00.563.00.571.01.082.01.093.01.0

表3 生根培养时激素的种类和浓度

2 结果与分析

2.1 不同消毒时间对紫菀根状茎和芽头的影响

不同的消毒时间处理后，供试紫菀的根状茎污染率和死亡率存在差异。在酒精消毒时间一定时，随着升汞消毒时间的延长，紫菀根状茎的污染率降低；在升汞消毒时间一定时，随着酒精消毒时间的延长，死亡率明显升高。培养6～7 d后，未污染和死亡的根状茎萌发出芽，在10～20 d开始出现叶片，在20～30 d叶片达到3片。从统计结果(见表4)综合考虑污染率和死亡率，最终选择75%酒精消毒30 s，0.1%升汞消毒10 min,紫菀根状茎污染率为32.5%，死亡率为37.5%，而且后期能进行正常生长。

表4 污染数和死亡数的统计

2.2 不同激素组合后对紫菀无菌苗增殖的影响

经观察发现：不同浓度组合的6-BA和NAA对紫菀试管苗增殖的影响不同。当NAA浓度为0.1 mg·L-1时，试管苗增殖不明显，相对于NAA为0.5 mg·L-1时的试管苗生长缓慢，接种的部分芽头形成多个芽，但部分褐化死亡。随着两种激素浓度的升高，形成丛生芽的数量增加，当NAA浓度达到1.0 mg·L-1时，部分试管苗基部形成了愈伤组织，而且形成的愈伤组织很难分化，尤其在6-BA浓度达到3.0 mg·L-1，NAA浓度达到1.0 mg·L-1时，部分试管苗开始玻璃化，停止生长。根据试管苗的增殖和生长情况，最终确定MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+蔗糖25 g·L-1+琼脂8 g·L-1为紫菀试管苗最佳的增殖培养基。培养一段时间后，丛芽增殖后生长旺盛。

2.3 生长素对紫菀试管苗生根的影响

通过生根实验发现，紫菀的试管苗生根容易，不添加任何生长素的情况下，试管苗培养14 d后即可生根，但是形成的根比较细，色白。当同时添加NAA和IBA各0.5 mg·L-1，培养一周，有部分根从试管苗基部冒出，相对较粗壮。但同时使用1.0 mg·L-1的NAA和IBA，试管苗基部形成很多的愈伤组织，部分愈伤组织分化出根，此种根不能供给植物营养。综合上述情况，最终确定MS+IBA0.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+蔗糖25 g·L-1+琼脂8 g·L-1为最佳的生根培养基。

3 总结和讨论

本文利用植物组织培养技术获得了亳州地产紫菀的试管苗。通过实验筛选，确定了紫菀根状茎适宜的消毒时间为75%酒精消毒30 s，0.1%升汞消毒10 min。试管苗增殖和生根的培养基分别为MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+蔗糖25 g·L-1+琼脂8 g·L-1和MS+IBA 0.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+蔗糖25 g·L-1+琼脂8 g·L-1。同时，研究发现，紫菀地下根状茎的取材时间与消毒时的死亡率有很大的关系。由于本研究的第一批和第二批实验分别开始于2017年3月和2017年4月，紫菀地下根状茎活力低，消毒时很容易死亡；第三批实验开始于2017年5月初，此时气温回暖，地下根状茎活力强，生长活跃，同样的消毒时间处理后，成活率高。紫菀植株全体被白色柔毛，用叶片做外植体消毒困难；用根状茎做外植体时，取材时间过早，活力低，不宜萌发；取材过迟，芽头变白色，细弱，消毒时易死亡。因此，选择适宜的取材时间是建立无菌体系至关重要的一环。

在组织培养培过程中，首次消毒成功后，虽然获得了无菌芽，但后期有一小部分植株叶背及芽头顶端极易出现团状的白色毛，停止生长；而且部分苗在无菌培养的过程中极易感染细菌，推测紫菀体内可能存在内生菌，但还需要更进一步的实验证实。