一种霉菌和酵母菌的快速检测研究

◎ 扶 胜，颜跃跃，周 绘，周 艳

（贵州勤邦食品安全科学技术有限公司，贵阳 贵州 550009）

霉菌和酵母菌均属真菌，广泛存在于空气、水和土壤中，种类繁多，具有很强的新陈代谢能力。霉菌可引起食物霉变，不仅影响食物外观和风味，而且摄入量过多会刺激人体消化道，导致肠胃不适，甚至引起疾病发生[1]。在适宜条件下，霉菌能够产生有毒的代谢产物——霉菌毒素，造成食物中毒并有致癌作用[2]，危及生命安全。酵母菌能够在低pH、低水活性、低湿度、高盐或高糖的食品中生长[3]，是引起这类食品腐败变质的主要菌株[4]，给食品工业带来了巨大的安全隐患[5]。

目前，我国已在饮品类、坚果类及米面制品类食品中将霉菌和酵母菌作为常见指示菌进行检测和控制，将其列入GB 4789.15-2010[6]系列食品安全微生物常规检测项目。关于食品中霉菌和酵母菌的检测，现行的检测技术也依赖于该标准，检测方法为平板法，是经典的微生物检测和鉴定方法，检测结果准确可靠，但耗时长且操作繁琐，难以满足快速检测的需求。2007年，PetrifilmTM测试片被正式列入中国出入境检验检疫行业标准，试纸片法弥补了平板法的缺陷，逐步成为微生物检测和鉴定的主要方法。近年来，关于霉菌和酵母菌快速检测试纸片的研究已有报道[7-8]，但这些方法均需要涂布和盖膜操作，引入人为操作不当导致判读结果有误的可能。本试验的开展，就是为了尽可能地简化实验操作步骤，提高试纸片对霉菌和酵母菌的检测效率，以获得可靠的检测结果，为霉菌和酵母菌的快速检测提供可靠的选择。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

胰蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、磷酸氢二钾、氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、孟加拉红、氯霉素、N,N-二甲基甲酰胺、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐和氯化硝基四氮唑蓝。

电热恒温鼓风机、智能恒温恒湿箱、高压灭菌锅、菌落计数器、精密pH计、电子分析天平、移液器、超低温冰箱和超净工作台。

1.2 方法

1.2.1 培养基的制备

（1）霉菌和酵母菌特征显色液体培养基制备。称取胰蛋白胨0.8～2.0 g、酵母粉0.4～0.8 g、葡萄糖1～4 g、磷酸氢二钾0.05～0.1 g、氯化钠0.05～0.2 g、磷酸二氢钾0.2～0.4 g、硫酸镁0.2～0.4 g、孟加拉红0.04～0.1 g置于烧杯中，用蒸馏水定容至100 mL，加热溶解后，用高压灭菌锅在121 ℃下灭菌15 min，冷却至室温后依次加入经过过滤灭菌的1～3 mL 0.1 g/mL的氯霉素及0.015～0.040 mL酶底物混合剂，得到液体培养基，在0～4 ℃下冷藏备用。

（2）酶底物混合剂制备。取2 g 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐和1 g氯化硝基四氮唑蓝，溶解于100 mL N,N-二甲基甲酰胺中。

1.2.2 测试片的制备

（1）滤纸片前处理。采用直径为70 mm的白色中速滤纸，用1.0～1.5 mL 0.05 mol/L Triton-Tris的缓冲生理盐水处理后，置于37 ℃恒温箱中干燥4 h后取出，放入含有干燥剂的自封袋中，室温保存备用。

（2）培养液吸附。取上述处理的滤纸片，121 ℃灭菌15 min后浸入培养基中浸泡5～10 min。取出后平放在已灭菌的超净工作台中，无菌条件下烘干，置于0～4 ℃的无菌冷藏箱内保存备用。

（3）组装。将上述得到的试纸片装入无菌培养皿中，盖好培养皿盖，将其置于铝箔袋中，抽真空封口，即得到快检产品。

1.2.3 测试片的使用方法

（1）样本的处理。取检测样本25 mL（g）放入225 mL灭菌稀释液（磷酸盐缓冲液或生理盐水）中，制成1∶10的样品匀液，吸取1∶10的样品匀液1 mL，注入含有9 mL稀释液的试管内，摇匀后得到1∶100的样品匀液，按上述方法依次稀释。一般样本选1～2个稀释度进行检测，含菌量少的液体样本（如饮用水、矿泉水等）可直接吸取原液进行检测。

（2）接菌。将测试片置于已灭菌的超净工作台上，打开上盖，用灭菌枪头吸取1 mL样品匀液加到测试片上，使液体润湿整张测试片，同时取1 mL稀释液接种于另一测试片作空白对照，加盖置于（28±1）℃培养箱中培养48～72 h。每个稀释度接种3片。

（3）结果统计。霉菌在测试片上呈现灰色、黑色和蓝绿色菌落，且菌落较大呈现其自身的形态；酵母菌再测试片上呈现绿色菌落，且菌落较小、表面平滑。

1.3 实验内容

将培养好的酵母菌液用灭菌稀释液稀释至10-6、10-7两个梯度，将霉菌稀释至10-1、10-2备用。

1.3.1 滤纸处理方式对实验结果的影响

设计两个处理，滤纸片经0.05 mol/L Triton-Tris缓冲生理盐水处理和不经处理，其他培养条件一致。吸取1 mL稀释好的菌液接种于本测试片上，以1 mL灭菌生理盐水作为空白对照，在（28±1）℃条件下培养48 h后进行结果统计。

1.3.2 本测试片与国家标准检测法、3M试纸片法对比实验

吸取1 mL稀释好的菌液接种于本测试片、国家标准法推荐的平板及3 M测试片上，以1 mL灭菌生理盐水作为空白对照，在（28±1）℃条件下培养48 h后进行结果统计。

1.3.3 不同培养时间下本测试片与国家标准检测法对比实验

设计两个时间梯度，吸取1 mL稀释好的菌液接种于本测试片及国家标准法推荐的平板上，以1 mL灭菌生理盐水作为空白对照，在（28±1）℃条件下培养48 h和66 h后进行结果统计。

2 结果与分析

2.1 滤纸处理方式对实验结果的影响

检测霉菌的结果表明，经过处理的滤纸与国家标准的准确率达92%，滤纸未经处理的与国家标准的准确率为84%；检测酵母菌的结果表明经过处理的准确率达103%，未经处理的为96%，说明经0.05 mol/L Triton-Tris缓冲生理盐水处理后的滤纸检测的结果更为准确。生理盐水在微生物培养过程中，能够保证细胞内外的渗透压平衡，使微生物稳定存在，从而使实验结果的准确性提高。

表1 滤纸处理方式对实验结果的影响表

2.2 本测试片与国家标准检测法、3M试纸片法对比实验

将本实验所得测试片与国家标准法和3M试纸片法进行对比实验，发现本测试片检测的结果与这两种方法的准确度均达到97%以上，且相较而言本测试片的实验结果差异小，结果稳定性好，见表2。

表2 本测试片与国家标准法、3M试纸片法的结果比较表

2.3 不同培养时间下本测试片与国家标准检测法对比实验

分别用本测试片和国家标准法培养样本48 h和66 h，实验结果表明，本测试片与国家标准的符合度均达到90%以上，其中培养霉菌的结果显示培养时间为66 h的准确度低于培养48 h，而培养酵母菌的结果显示培养时间为66 h准确度反而高于培养48 h的处理。说明本测试片的检测结果可以达到国家标准。

表3 本测试片与国家标准法测试结果对比表

3 讨论

本实验得到一种可以同时用于检测霉菌和酵母菌的快速检测试纸片，利用微生物生化反应的特性，将微生物胞内酶的种类及反应条件作为微生物分类鉴定的主要依据，通过在培养基中加入特异性酶显色底物，当目的菌在培养基上生长时，其特异性酶就能降解显色底物，并产生带有特殊颜色的代谢物，使菌落呈现特定的颜色或形态，从而实现样本中霉菌和酵母菌的检测。且本测试片操作简便、培养48 h时判读检测结果准确率达到国家标准检测方法97%以上，满足实际检测需求，具有很高的使用价值。