人间充质干细胞成脂分化调控机制的研究

单志强 许西 郭文婕

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一种来源于发育早期中胚层干细胞，具有干细胞的特性，来源广泛，是开展干细胞移植、工程技术的理想种子细胞[1-2]。人MSCs成脂分化技术有成为人体软组织修复技术，但MSCs的分化受到多种因素的影响，有关于调控机制的研究较少[3]。本文尝试就此进行探。

1 材料方法

1.1 实验材料

从健康骨髓捐献骨髓中获得5～10 ml样本，采用传统的人淋巴细胞分离液密度梯度离心法获得骨髓单个核细胞。

1.2 仪器与试剂

试剂：DNA提取试剂盒，PCR鉴定引物，DMEM/F-12完全培养液，平衡盐溶液PBS，胎牛血清、MTT试剂盒、双抗等。仪器主要包括酶标仪、水浴锅、低温高速离心机、倒置显微镜照相系统、PCR仪、超净工作台、CO2细胞培养箱、高压蒸汽灭菌锅、普通离心机、超低温冰箱等。

1.3 方法

1.3.1 培养、鉴定 将获得的骨髓单个和西北，采用原代培养法进行培养，导致显微镜评估原代BM-MSCc贴壁生长情况，结果显示贴壁良好，呈放射状克隆性生长。而获进行穿戴培养、扩增，获得第一代细胞计为P1，而后继续培养，当细胞生长到80%～90%融合，继续采用消化离心穿戴培养法培养，依次将第2-n代细胞记作P2、P3、P4……，Pn代细胞。将获得的各代细胞，1 200 rpm/5 min，室温下离心，弃上清，采用DMSO冻存液重悬细胞沉淀，调整浓度为2.4×106/ml，每个冻存管1.5 ml悬液分装，4 ℃冰箱保存30 min，而后-20 ℃冻存1 h，转移到-80℃冰箱放置过夜，次日液氮罐保存，在1个月内使用。使用前，进行复苏，以供使用。使用前，进行BM-MScs表面分子标志检测，采用藻红蛋白（PE）标记小鼠抗人单克隆抗体CD90、CD73、CD71、CD44、CD29、CD34、CD31，异硫氰酸荧光素标记小鼠抗人单克隆抗体GAPD标记，同时分别采用相应PE-小鼠抗人IgG1、FITC-小鼠抗人IgG1作为同型对照抗体。

1.3.2 成脂分化能力与基因表达鉴定 （1）诱导BM-MSCs向脂肪细胞分化：①消化、离心收集P4-P6代BM-MSCs，采用4×104孔接种细胞，培养24 h，代细胞贴壁，弃培养液；②每孔加入2 ml成脂诱导培养基继续培养，每隔3日，换液1次，持续14日；③完毕后弃培养液，PBS缓冲液洗洛细胞2次，4%甲醛固定30 min，PBS缓冲液洗涤细胞3次；④每孔加入0.2%油红O染色1～2 m，37℃染色孵育30 min，吸去染液，PBS缓冲液洗涤细胞3次；⑤导致显微镜检查。

（2）成脂细胞特异性基因RT-PCR检测：对照组、成脂分化实验组各个时间点，采用75 cm2培养瓶培养，培养后获得细胞层，加入500 μl蛋白质裂解液，冰上裂解，期间晃动培养瓶，保证裂解液覆盖在每一个角落，裂解完后，细胞刮刀刮下破碎的细胞悬液，转入1.5 ml EP管，13 200 rpm，4 ℃离心20 min，转入上清到EP管，沸水浴5 min使蛋白变性，冷却后离心，转移到新的EP管，分出100 μl定量，其余-70℃保存，收集蛋白质。采用Real-Time PCR验证质谱分析，以差异蛋白组学分析得到的脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）、过氧化物酶体增殖剂激活受体（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为检测对象，利用NCBI数据库设计引物，设计这些蛋白质的基因R-t PCR反应引物。

2 结果

2.1 间充质干细胞培养、传代情况

分离培养得到的间充质干细胞，倒置显微镜观察显示如下，接种后可间少量形态各异的细胞贴于培养瓶底部，梭型、多角形不规则散在分布，培养5～7日后，贴壁成克隆性生长，14～21日细胞密度达到80%～90%融合，细胞排列整齐，细胞形态逐渐均一，成长梭型。见图1 A～D。

图1 间充质细胞-原代细胞培养各个时间表现情况

2.2 表面标记免疫荧光检测

表面标记免疫荧光检测结果如下，P3、P9、P16代的间充质干细胞CD90、CD73、CD71、CD44、CD29、GAPDH表达不存在显著差异，在进行传代培养后，维持比较稳定的免疫表型标志物表达谱。从上到下分别为CD90、CD73、CD71、CD44、CD29、GAPDH免疫表现，从左边到有分别为第P3、P9、P16代细胞，见图2。

2.3 向脂肪细胞诱导分化后的油红O染色镜下表现

诱导前5天，细胞形态没有明显变化。诱导第7天，部分细胞形态发生改变，形态学观察显示，诱导后的细胞体积增大，少部分细胞胞质内开始出现小脂滴。诱导10天后，含脂滴的细胞数量明显增加，随着细胞诱导时间的进行，小的脂滴汇合形成大的脂滴。在高倍镜下观察发现，诱导14天后含有脂滴的细胞数量比例明显增多。未加成脂诱导剂的对照组细胞形态始终没有明显变化，细胞内也没有脂滴出现。分别取实验组和对照组诱导后第5天、10天、14天的细胞进行油红O染色，可见实验组第7天开始细胞内出现脂滴并被染成红色，而且脂滴数量随着诱导天数的增加而增加并由小的脂滴逐渐聚集成大的脂滴。而对照组细胞油红O染色均呈阴性。

图2 表面标记免疫荧光检测结果

2.4 脂肪细胞特异性基因检测

脂肪细胞特异性基因RT-PCT检测结果如下，相较于对照组，实验组第7天、10天、14天的LPL、PPAR-γ基因表达高于对照组（无表达），同时随着时间的延长，表达信号强度明显逐渐上升，提示间充质干细胞成脂化与LPL、PPAR-γ基因表达有关，见图3。

图3 脂肪细胞特异性基因RT-PCR检测

3 讨论

LDL即脂蛋白脂肪酶基因，其中内含子6中PVU Ⅱ多态位点和内含子8中HindⅢ多态位点与高脂血症有关，并为高脂血症的家系连锁分析提供了遗传标记，增加CM残粒结合到LPL受体的能力[4-5]。本次研究显示，人间充质干细胞成脂分化可能与LPL、PPAR-γ基因表达增强有关，特别是在第7日达到脂分化高峰，在第10日仍然呈现持续脂分化。提示PPARs控制许多细胞内的代谢过程，是重要的细胞分化转录因子，在哺乳动物脂肪组织中呈现高表达[6-7]。在敲除PPAR-γ基因试验中，小鼠往往会在胚胎期死亡，体现PPAR-γ基因的重要性[8]。PPAR-γ基因与脂代谢过程中的多种基因如脂肪酸吸收（LPL）、脂类运输（Fabp4）等关系密切，通过调节脂肪因子表达，从而参与成脂化[9]。

需要注意的是，本文中采用诱导剂诱导成脂化，而充间质干细胞的分化影响因素较多，其他成脂分化的具体机制有待进一步研究[10]。除以上特异性基因外，还存在其他许多脂肪因子基因，有鉴于成脂化的复杂机制，需要开展更多的基因分析，以构建基因表达网络，为成脂化调控提供理论基础[11-12]。由此可见，人间充质干细胞成脂分化可能与LPL、PPAR-γ基因表达增强有关。

综上所述，人间充质干细胞成脂分化可能与LPL、PPAR-γ基因表达增强有关。