从肉牛脂肪组织中提取总RNA技术方法的改进

李 娜，余群力，李红波，闫向民，张金山，袁理星，杜 玮，崔繁荣，叶治兵，张 杨*

(1.甘肃农业大学，兰州 730000；2.新疆畜牧科学院畜牧研究所，乌鲁木齐 830000)

RNA提取技术是现代分子生物技术中一种常用技术，也是做好功能基因组学技术的第一步。其产量、纯度决定了分子克隆和基因表达等研究数据的可靠性[1]。提取总RNA对Northern印迹及杂交分析以及主要由脂肪组织分泌合成的基因表达情况的试验是至关重要的。到目前为止，已有大量利用各种和商业化试剂成功提出高质量RNA的文献[1]。由于组织特异性，某些特殊组织中总RNA的丰度极低(如脂肪，脑、骨骼肌等)，按照常规或是试剂说明书的通用步骤不能得到高质量的RNA。在做基因RT-PCR定性分析过程中，很难进行反转录，进而阻碍研究的进展。因此本文以脂肪组织为材料，经反复试验，在试剂公司提供的RNA提取操作步骤基础上进行优化和改进。得到符合试验要求高质量的RNA。并利用改进后方法提取肉牛肌间、皮下、肾周和心周脂肪各组织中总RNA，进行了瘦素基因(Lep)在以上四个部位脂肪组织中的表达差异性研究。

1 材料与方法

1.1 试验样品采集

参照张宁的方法进行采集脂肪样品(肌间脂肪、肾周脂肪、皮下脂肪、心周脂肪)300 g/样品立即投入液氮速冻，贴好标签、保存液氮中。

1.2 主要仪器、试剂及PCR引物

1.2.1 主要仪器及试剂 Light Cycler 2.0荧光定量PCR仪；紫外分光光度计；TRIzol® Total RNA Reagent 总RNA提取试剂。

1.2.2 PCR引物 Gapdh内参对照上游引物：5＇TCATAGACAAGATGGTGAAGGTC3，，下游引物：5＇AGACACCGTGAAAAGGAGA 3＇产物长度163 bp；牛Lep基因上游引物：5＇TCATAGACAAGATGGTGAAGGTC 3，，下游引物：5，CACTGAATGTTTGTGGAATG 3＇产物长度207 bp；引物由上海生物工程有限公司合成。

1.3 总RNA的提取

按照TRIzol试剂说明书进行脂肪组织总RNA的提取，由于肌间脂肪、肾周脂肪、皮下脂肪、心周脂肪等脂肪组织含有大量的油脂，而且RNA的丰度极低，所得含量极少。因此，特别对试验部分操作步骤做了相应的优化与改进，希望从中获得较高质量的总RNA。TRIzol试剂说明书操作步骤优化与改进关键点如下图所示：

其TRIzol试剂说明书操作步骤优化与改进关键点

(1)加大样品量，在离心管中加入少许液氮，依次加入样品充分混匀，延长静置时间，使细胞完全裂解；

(2)萃取时将粘在离心管的脂肪取出，取得的下层溶液需做同样的二次离心，以保证完全去除脂类污染。将两个平行样吸取上层水相，都置同一个新的离心管中解决提取过程中RNA浓度低的问题；

(3)沉淀RNA时，轻摇混匀、冰上放置、缩短静止时间减少降低RNA降解；

(4)洗涤去除DNA时，75%的乙醇必须用特制水配制可抑制RNA酶，延长RNA保存时间，此步骤重复一次可有效除去基因组DNA污染。

2 结果与分析

2.1 脂肪组织总RNA琼脂糖电泳

为进一步检测所提取总RNA的质量，用1%甲醛变性胶电泳检测，120V，15 min，UV凝胶成像仪下照相(图1、2、3)。

图1 按说明书所提肌肉中的RNA的电泳结果 图2 按说明书所提的脂肪中RNA的电泳结果

由图1可知，按照TRIzol说明书操作方法提取肌肉中的RNA条带比较清晰，说明完整性好，得率高。但是图2中按照说明书操作方法提取脂肪组织中的RNA有基因组DNA污染，28S与18S的rRNA带不清楚得到的RNA纯度及浓度无法进行后续试验。由图3可知经过对操作方法改进后，脂肪组织中RNA制品没有受到基因组DNA污染，条带比较清晰，28S和18S的rRNA亮度比值约为2/1，表明RNA制品纯度高且完整性好产量高。

图3 TRIzol操作方法改进后所提的RNA的电泳结果

2.2 操作方法改进前后RNA的纯度和得率比较

用紫外分光光度计分别检测脂肪及肌肉样品中提取的RNA 纯度及得率，用Graphpad prism统计软件进行统计分析，结果见表1：

表1 提RNA操作方法改进前后的纯度和得率比较

注：同列数据进行比较，不同大写字母的表示差异极显著P<0.01。

由表1可知，改进后脂肪组织中的RNA与未改进肌肉组织中的RNA的纯度差异不显著，但得率差极显著(P<0.01)，与未改进脂肪组织中的RNA的纯度、得率差异极显著(P<0.01)。

2.3 试验成本比较分析

RNA提取已经成为现代分子生物学一项很成熟的技术，但由于RNase酶非常稳定不易灭活，很难在实际研究中获得高质量的RNA[2-3]。目前，成本价为1600元/100次的TRIzol试剂可提取各种组织中RNA，经对部分步骤进行改进和优化后，可提取RNA含量少的脂肪组织中的RNA，其提取的RNA纯度和浓度完全可以满足后续试验的要求，与成本价约为3 000～5 000元/100次脂肪组织总RNA的试剂盒相比，体现成本低廉，并能取得理想的试验效果。

综上所述，通过TRIzol方法部分步骤改进和优化后，试验结果得到了符合后续试验要求的高质量RNA，同时该方法所用试剂价格低廉，完全可以替代价格昂贵的试剂盒进行脂肪组织中总RNA的提取。因此，在实际应用中，可根据需要选择适合试验条件和要求的运用此方法。

2.4 开展Lep基因的在不同脂肪组织中的表达差异

在伊犁西天山农牧发展有限责任公司随机选取舍饲条件下、年龄、营养条件均一致的成年新疆褐牛公牛20头，屠宰后并采集脂肪样品(肌间脂肪、肾周脂肪、皮下脂肪、心周脂肪)立即投入液氮速冻，贴好标签、保存液氮中开展Lep基因在不同脂肪组织中表达差异的研究。

按照改进后的方法，分别从肌间、皮下、肾周、心周脂肪组织中提取并纯化获得高质量的RNA，以Lep、Gapdh为引物进行RT-PCR反应，反应产物进行琼脂糖凝胶电泳。本试验以肌间脂肪为参照，采用Graphpad prism统计软件对不同部位Lep基因表达差异性进行研究。反应产物的琼脂糖凝胶电泳及数据统计结果如图4、表2。

经统计结果表明，Lep基因在新疆褐牛不同部位脂肪组织中的表达量是不同的。Lep在肌间脂肪组织表达量极显著高于肾周、皮下脂肪组织(P<0.01)如：表2、图5。

M：D2000 marker；1、2、3、4、6：RT-PCR产物

表2 Lep基因在不同脂肪组织的表达水平

以肌间为对照同行数据间进行单因子方差分析， *表示P<0.05差异显著，**表示P<0.01差异极显著。

图5 Lep基因在不同脂肪组织中的表达水平

3 讨论

成年动物的脂肪组织单位体积细胞数量与其他组织相比较少，脂质含量丰富[4-5]，因而每毫克组织样品所含总RNA的量小于0.05μg，若增加组织块的量，造成总RNA得率较低。当RNA的量很少时，不仅造成电泳时极有可能看不见条带，就不知道其是否完整，也就不能通过观测RNA的完整性来推测mRNA是否降解。而且使RNA反转录的DNA的浓度低，荧光定量PCR标准曲线线性差。按照试剂公司说明书提取脂肪组织中RNA效果不理想。本研究以脂肪组织为材料，在总RNA提取试剂盒说明书操作步骤基础上，优化和改进提取过程中的一些步骤，对脂肪组织进行提取前处理、缩短了RNA沉淀时间，有效除脂，改变了静止方式有效的减少RNA降解。得到了符合试验要求的高质量、高纯度的总RNA。不仅能用于脂肪组织，也可以用于RNA得率较低的组织如：心脏、骨骼肌等纤维组织或脑等富含脂肪较多的组织。

Lep在成熟的脂肪细胞中，可以直接促进甘油三酯的分解，降低脂肪合成[6-8]。利用改进后的RNA提取方法，成功的提取新疆褐牛肌间、皮下、肾周、心周脂肪组织中高质量RNA，经相对定量PCR反应发现，Lep在四个部位都有表达，但在肌间脂肪组织表达量极显著高于在其他脂肪组织中的表达水平，表明Lep基因表达具有组织特异性。

4 结论

本研究通过优化和改进提取步骤，对RNA含量少的脂肪组织有效除脂，减少了RNA降解，降低提取成本，得到了符合试验要求的高质量的RNA。在后续新疆褐牛脂代谢调控Lep基因在不同部位脂肪组织中表达试验中得到了可靠的数据。为今后RNA定量或定性试验以及新疆褐牛肉用新类型选育提供技术支撑。