盐节木基因组大小的测定

王 霞, 陈慧泽, 李永峰, 韩 榕, 陈 惠

(山西师范大学 生命科学学院， 临汾 041004)

盐节木(Halocnemumstrobilaceum)是藜科(Chenopodiaceae)盐节木属(Halocnemum)的一种耐盐半灌木植物，植株较小且肉质化,多分布于盐碱地区[1]。盐节木主要生长在我国新疆和甘肃等北部地区，为耐盐耐旱的植物类群[1-2]。目前，关于盐节木的研究多集中在种子的萌发与幼苗生长的影响[1,3]、群落特征、提取和开发植物次生代谢产物类物质[4-5]等方面。近年来，还进行了盐节木耐盐基因的克隆和表达[6]、组织培养快速繁殖[7]及盐促进根伸长的机制等的研究[8],但其基因组大小的研究还未见报道。甜菜(Betavulgaris)同盐节木一样，也属藜科(Chenopodiaceae)，二年生草本植物，物种为二倍体，体内含18条染色体[9]。

基因组的大小(又称C值，)是指一个物种单倍体核DNA的含量，单位以质量(pg)或是碱基对数目(Mbp)表示,其换算关系为1 pg=978 Mbp或1 Mb=1.022×10-3pg[10]。物种基因组大小的测定，为分子与细胞遗传、植物的基因组学及其亲缘进化关系研究提供了重要的基础资料[11]。

早期的流式细胞仪主要用于动物实验研究上，用来测定植物细胞DNA含量的出现较晚。流式细胞仪可对样品进行自动测定分析，检测器捕捉样品悬浮液中被染色的细胞核所激发后的荧光信号，通过随机软件自主设计参数要求进行量化分析，比较待测样品和内参样品的相对荧光强度从而计算出DNA含量[12]。流式细胞术测定基因组大小的制样方法简便，检测结果较为可靠稳定，该方法目前已广泛应用于生物等领域的研究。

本研究用Otto裂解液获取两种植物叶片的单细胞悬浮液，以藜科甜菜属植物甜菜(Betavulgarisssp.vulgaris，758 Mbp,NCBI at http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/)作为内参植物，用流式细胞仪对每个样品进行上样测定。通过比较,计算出盐节木基因组的大小，为物种鉴定、分类研究及盐节木的基因组测序研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

盐节木种子(采自新疆古尔班通古特沙漠南缘五家渠市蔡家湖盐节木自然分布的群落中)；甜菜种子(购自腾辉种业公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 植株培养

取甜菜种子，冷水浸泡过夜后，播种于蛭石∶营养土=1∶1的营养砵中。盐节木种子经70%乙醇和0.1%升汞分别消毒1 min和8 min及无菌水冲洗3～4次后，无菌纸吸干水分后接种培养在MS基本培养基上，培养2个月后，从培养基转移到营养砵中(蛭石∶营养土=1∶1)再培养2～3个月。培养条件见遆卫国等[7]、房娟娟等[8]的研究。

1.2.2 盐节木与甜菜细胞大小观察

为了确定两种样品的取材量和流式上样量，特观察了两种植物叶片的细胞大小。方法为徒手切片法，分别取干净的盐节木同化枝与甜菜嫩叶，用单面刀片切取厚为0.1 mm的薄片，置于干净载玻片上，滴加一滴蒸馏水，盖上盖玻片，在Olympus(CX21FS1)显微镜下观察二者细胞的大小并摄片。

1.2.3 基因组大小的测定

1)细胞悬浮液的制备。盐节木同化枝与甜菜嫩叶细胞核悬浮液的制备参考Dolezel等[13]的方法，并进行优化和调整。称取盐节木同化枝300 mg，在滴有1 mL的OttoⅠ(100 mmol/L柠檬酸，0.5%(V/V)吐温-20，pH 3.0，0.22 μm孔滤膜过滤，4℃保存)的预冷培养皿中，用单面刀片快速将盐节木同化枝切成约1 mm厚的薄片，冰上孵育5 min后400目尼龙网过滤到离心管中，1000 r/min离心5 min，用移液枪弃去上清，收集沉淀细胞，再加入100 μL OttoⅠ置于4℃环境中备用。采用同样方法制备内参植物甜菜和二者混合样品的细胞悬浮液。

2)DNA特异染色。向制备好的100 μL细胞悬浮液中各加入280 μL的OttoⅡ(400 mmol/L十二水合磷酸氢二纳，pH 8.0，0.22 μm 微孔滤膜过滤，常温避光保存)，60μL碘化丙啶(PI,1mg/mL，0.22μm水系微孔滤膜过滤，)和60 μL RNase(1 mg/mL，预先煮沸，0.22 μm水系微孔滤膜过滤，)，轻微摇晃，避光染色10 min后上机检测。

3)流式细胞仪检测。流式细胞仪(BD FACSCCalibur,USA)开机预热30 min，利用488 nm的氩离子激发光，检测PI的荧光强度，每个样品重复测定6次，每次至少获取一万个细胞。用随机软件Modfit LT(Mac for version3.0)进行数据整理和分析，变异系数控制在6%以下。所测样品的DNA含量均是以甜菜的DNA含量为标准的相对值。根据公式P=F1/F2H(P为待测样品的DNA含量，F1为待测样品的荧光强度，F2为内参样品的荧光强度，H为内参样品的DNA含量)可计算出待测样品的DNA含量[14]。

2 结果与分析

2.1 盐节木与甜菜细胞大小的观察

由徒手切片制片观察如图1所示，盐节木同化枝与甜菜嫩叶二者细胞的大小差异不大，所以研究过程中两种材料的叶片均称取相同重量，来获得样品的细胞核悬浮液，同时在流式细胞仪上样量方面也保持盐节木与甜菜取样量一致。

图1 盐节木与甜菜细胞大小观察(a)甜菜;(b)盐节木Fig 1 The cell size observation of Halocnemum strobilaceum and Beta vulgaris (a)Beta vulgaris;(b)Halocnemum strobilaceum

2.2 盐节木、甜菜细胞悬浮液碘化丙啶染色分析

实验材料均在OttoⅠ裂解液中进行破碎并分离获得完整的细胞核，OttoⅠ裂解液中的0.5%(V/V)Tween-20具有促进作用，能够获得更多的细胞核。碘化丙啶为常用的核酸染料，最大吸收峰在488 nm处，研究用碘化丙啶较另一种核染料DAPI相比，更适合本次流式细胞仪的测定结果。实验用了60 μg/500 μL的碘化丙啶，流式分析参数设为FL2-A,仪器检测样品出峰快、稳定且粒子清晰集中。

2.3 盐节木、甜菜基因组大小分析

用碘化丙啶标记的实验样品核DNA，在流液系统中通过激光照射，会产生荧光信号。其中散射光的强度和空间分布与细胞的形态、大小、膜及细胞内部结构密切相关，荧光强弱与样品核DNA含量成正比。荧光信号经光电倍增管接收，转换为电信号和可被计算机识别的数字信号，可通过计算机随机软件显示并进行量化分析，因此能用于测定生物的基因组大小[15]。仪器测定的精确度由G0/G1期峰的变异系数CV来反映，CV%=(SD/mean)×100%，本实验的变异系数控制在6%以下，结果可靠。实验测定结果的图像如图2所示。通过G0/G1期峰值比较发现，即荧光道数峰值比，盐节木基因组是甜菜基因组的0.875倍，由此计算出盐节木基因组的大小为 663.25 Mbp,或相对DNA含量为0.678 pg。研究为后续分子和基因组等相关方面奠定了基础。

图2 流式散点图和直方图Fig 2 Subcellar scatter plots and histograms by FCM (a,b,d,e,g,h)The subcellar scatter plots;(c,f,i)The histogrms;(a,b,c)Beta vulgaris;(d,e,f)Halocnemum strobilaceum;(g,h,i) The mixed samples

a、b、d、e、g、h：散点图;c、f、i：直方图。a、b、c：甜菜;d、e、f：盐节木;g、h、i：混合样图

3 讨论

目前，常规用来测定基因组大小的方法有显微分光光度法，孚尔根光密度测量法和流式细胞术。其中因流式细胞术制样简便，检测速度快且较为准确等优点，已被广泛用于测定物种的基因组大小。但由于不同研究者所采用仪器、裂解液、材料类型、测定方法、参数设计及控制等因素上的差异，同一物种的基因组大小的检测结果可能会稍有差异[16]。流式细胞术分析中，合适裂解液的选择对实验结果有明显的影响。受裂解液各自化学成分差异、植物组织细胞的多样性等影响，不同裂解液对不同材料的裂解效果有很大的差异。Loureiro等[17]在植物上比较了4种不同细胞裂解液的结果，发现Otto′s的裂解效果较好，因此本研究也参照选用了Otto作为细胞裂解液，且经实验证实，适合作为本研究的裂解液使用。其次，内参物种的选择对物种基因组大小的测定也有影响。Bennelt等[18]认为内参选择时，要考虑两种物种基因组大小的差异，差值太大或太小都不利于流式测定，且要有稳定遗传性等条件。同时在进行植物基因组大小测定时，应尽量选用植物材料，而非动物材料作为内参，以减少实验误差。我们选择甜菜作为内参是因为甜菜与盐节木同属于藜科植物，亲缘关系比较近，推测基因组大小也相近。研究结果表明：二者基因组大小的确相近，甜菜的基因组大小为758 Mbp,盐节木的基因组大小为663.25 Mbp，盐节木的基因组比甜菜的基因组小94.75 Mbp。

在流式细胞仪的结果分析中，样品的前期处理，可保证分析结果的准确性和精确度。本研究选用了嫩的盐节木同化枝，取材后立即制样、染色及检测，进而保证了样品的活性，同时确定了本实验合理的离心转速为1000 r/min，获得了较为纯净的单细胞悬浮液，仪器检测的样品峰图良好。而CV值作为检验实验精度的一个标准，本研究在一系列条件的控制下，实验样品的CV值均在6%以下。