FoxO1 DNA甲基化在同型半胱氨酸致肝细胞凋亡中的作用

谢琳 丁宁 徐灵博 姜怡邓 杨晓玲 马胜超 焦运

1宁夏医科大学基础医学院（银川 750004）；2宁夏医科大学总医院（银川 750002）

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是蛋氨酸代谢的中间产物，已被证实是动脉粥样硬化（ath⁃erosclerosis，As）重要的独立危险因子之一［1］。最近的研究表明Hcy水平与肝病的发生发展关系密切［2］，同时有文献报道［3］Hcy可以诱导肝细胞发生内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERs）。叉头状转录因子O1（forkhead box transcription factor O1，FoxO1）是FoxO亚家族中的主要成员之一。据报道，FoxO1主要在糖脂代谢活跃的器官，如肝脏、脂肪和骨骼肌等中表达，在动物的生长发育、细胞分化、代谢及凋亡信号转导等方面都发挥着重要的生物学功能［4］。ERs是各种原因导致的未折叠或错误折叠蛋白质在内质网的堆积，而长时间处于ERs状态或ERs超过自身处理能力时，内质网会启动程序性细胞凋亡过程，从而引起细胞凋亡［5］。DNA甲基化作为一种重要的表观遗传学调控，常发生在富含CpG岛序列的胞嘧啶5′位上，使得被修饰的DNA空间结构或染色体结构发生改变而导致基因表达改变［6］。然而，有关同型半胱氨酸诱导的内质网应激致肝细胞凋亡的报道却鲜有报道。因此，本研究主要探讨Hcy诱导ERs致肝细胞凋亡过程中FoxO1的调控作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器同型半胱氨酸、叶酸和维生素B12（美国，Sigma）；Annexin V⁃FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（上海，Best bio）；基因组DNA提取试剂盒、总RNA提取试剂盒（北京，天根）；逆转录和qRT⁃PCR试剂盒（美国，Thermo Fisher）；蛋白提取试剂盒、蛋白定量试剂盒（南京，凯基）；DNA甲基化修饰试剂盒（美国，ZYMO）；FOXO1抗体（英国，Abcam）；引物由上海生工生物工程有限公司合成。超净工作台（苏州，安泰）；CO2培养箱（德国，Heraeus）；5415D型微量台式离心机（德国，Ep⁃pendorf）；BS110S型精密天平（德国，Sartorius）；荧光定量PCR仪（上海，枫岭）；垂直电泳仪和Mod⁃el680全自动酶标仪（美国，Bio⁃Rad）。

1.2 方法用 含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养人肝细胞，置于37℃、5%CO2浓度的培养箱中。当细胞密度达到80%左右时，用终浓度为0μmol/L Hcy、100μmol/L Hcy和100μmol/L Hcy+叶酸+维生素B12干预，其中0μmol/L Hcy为对照组，100μmol/L Hcy为Hcy组，100μmol/L Hcy+叶酸+维生素B12为干预组。干预细胞48 h后，收集细胞用于后续实验。

1.2.1 流式细胞仪检测肝细胞凋亡水平用不含EDTA的胰酶消化肝细胞后离心，收集细胞。用冷PBS洗涤细胞2次，1 000 g、4℃离心5 min收集细胞。用400μL 1×Annexin V结合液悬浮细胞，浓度大约为1×106cells/mL。加入5μLAnnexin V⁃FITC染色液，轻轻混匀后于4℃避光孵育15 min。加入10μL PI染色液后轻轻混匀于4℃避光孵育5 min。立即用流式细胞仪检测，以FITC和PI荧光作双参数点图，细胞分为4个象限：左下象限为活细胞，右下象限为早期凋亡细胞，右上象限为晚期凋亡和死亡细胞，左上象限为机械损伤细胞。

1.2.2 qPCR检测内质网应激相关基因及FoxO1mRNA的表达根据试剂盒说明书提取肝细胞总RNA，GeneBank数据库查询FOXO1及内质网应激相关基因GRP78、ATF6、PERK、XBP⁃1序列并设计引物。FoxO1：上游：5′⁃AAGAGCGTGCCCTACTTC⁃AA⁃3′，下游：5′⁃TTCCTTCATTCTGCACACGA⁃3′；GRP78：上游：5′⁃GCTGGTGTCCTCTCTGGTGA⁃3′，下游：5′⁃ATTATCGGAAGCCGTGGAG⁃3′；ATF6：上游：5′⁃GGCAGTGTGGTCTTTCCTGT⁃3′，下游：5′⁃AAGCATCCGTTCTCATCACC⁃3′；CHOP：上游：5′⁃ACAGAGGTCACACGCACATC⁃3′，下游：5′⁃CTCCT⁃GCTCCTTCTCCTTCA⁃3′；XBP⁃1：上游：5′⁃AAAC⁃AGAGTAGCAGCTCAGACTGC⁃3′，下游：5′⁃TCCTT⁃CTGGGTAGACCTCTGGGAG⁃3′。PCR 扩 增程序：95℃ 5 min，95℃ 1 0 s，54 ℃ 3 0 s，72℃ 3 0 s，72 ℃10 min，共40个循环，并设空白对照和内参（GADPH）对照，同体系扩增目的基因的相对量根据公式2⁃△△Ct计算，△△Ct=［CtASPP（2待测样本）-CtGADPH（待测样本）］-［CtASPP（2校正样本）-CtGADPH（校正样本）］。

1.2.3 Westernblot检测FoxO1蛋白表达取30μg总蛋白并加入上样缓冲液煮沸变性5 min，经SDS/PAGE凝胶电泳，电转移至PVDF膜，封闭后与1∶1 000稀释的一抗在4℃孵育过夜，再与1∶5 000稀释的二抗室温孵育2 h，PBST清洗3次，每次5 min，曝光。用凝胶图像分析成像系统进行扫描分析，结果以目的条带面积灰度值做半定量检测。

1.2.4 nMS⁃PCR检测FoxO1启动子区DNA甲基化水平按DNA提取试剂盒说明书提取各组细胞全基因组DNA，亚硫酸盐修饰法对全基因组DNA进行甲基化修饰。nMS⁃PCR法检测FoxO1启动子区DNA甲基化程度的改变。针对FoxO1启动子区，在线（http：//www.urogene.org/cgi⁃bin/methprimer/methprimer.cgi）设计一对外引物及两对内引物（外引物：上游：5′⁃TTAGGTGTGTGGTGATGTTAGGTAT⁃3′，下游：5′⁃CAAACAACAAAACTCCAAATAACAT⁃3′；甲基化引物：上游：5′⁃TAGAGTTGTAGAAGAC⁃GA CGGTC⁃3′，下游5′⁃CAAAAAAATATAAAAAAA⁃CATCGAA⁃3′；非甲基化引物：上游：5′⁃TAGAGTT⁃GTAGAAGATGATGGTTGA⁃3′，下游：5′⁃CAAAAAA⁃ATATAAAAAACATCAAA⁃3′）。（反应体系：PCR MIX 12.5μL、H2O 7μL、上下游引物各1μL、已修饰的DNA 3.5μL，共25μL）外引物扩增的反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，20个循环，每个循环降0.5℃至53℃，72℃7 min。以外引物的PCR产物为模板，进行内外引物的扩增，反应条件同外引物。随之，取5μL PCR产物于2%的琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶成像分析仪成像并分析甲基化条带及甲基化条带的光密度，按如下公式进行计算：甲基化/%=甲基化OD值/（甲基化OD值+非甲基化OD值）×100%。

1.2.5 统计学方法采用Prism 5.0统计软件对实验数据进行分析整理，计量资料以s表示，多组间两两比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人肝细胞凋亡水平Annexin⁃VFITC染色、流式细胞定量定性分析肝细胞凋亡水平，结果显示：与对照组相比，Hcy组肝细胞凋亡水平增加（P＜0.05），而干预组较Hcy组凋亡水平降低（P＜0.05）。见图1。

图1 Hcy对肝细胞凋亡的影响Fig.1 Effect of Hcy on hepatocyte apoptosis

2.2 肝细胞内质网应激相关基因mRNA表达水平为了证明内质网应激（ERS）在肝细胞凋亡中的作用，采用qRT⁃PCR检测肝细胞内质网应激相关基因GRP78、ATF6、PERK及XBP⁃1 mRNA的表达水平。结果显示：与对照组相比，GRP78、AFP6、PERK、XBP⁃1 mRNA在Hcy组中明显升高（P＜0.001，P＜0.01，P＜0.001，P＜0.001），而干预组较Hcy组有所降低（P＜0.001，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.001），差异具有统计学意义。见图2。

图2 肝细胞内质网应激相关基因mRNA的表达水平Fig.2 Expression levels of mRNA for genes related to endoplasmic reticulum stress in hepatocytes

2.3 FoxO1在Hcy致肝细胞凋亡中的表达qRT⁃PCR和Western blot分别检测FoxO1 mRNA及蛋白的表达水平，结果显示：与对照组相比，Hcy组FoxO1 mRNA和蛋白表达水平均明显升高（P＜0.01，P＞0.05），而干预组较Hcy组下降（P＜0.001，P＞0.05）。见图3。

2.4 人肝细胞FoxO1DNA甲基化水平改变nMS⁃PCR检测FoxO1 DNA甲基化水平，结果显示：与对照组相比，Hcy组FoxO1 DNA甲基化水平降低（P＜0.05），而干预组与Hcy组比较，FoxO1 DNA甲基化水平升高（P＜0.05），差异具有统计学意义。见图4。

图3 FoxO1在Hcy致肝细胞凋亡中的表达水平Fig.3 Expression levels of FoxO1 in Hcy⁃induced hepatocyte apoptosis

图4 nMS⁃PCR法检测FoxO1的DNA甲基化水平Fig.4 DNA methylation levels of FoxO1 detected by nMS⁃PCR

3 讨论

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是一种含巯基的非必需氨基酸，主要来源于饮食摄取的蛋氨酸，是多种疾病的危险因子［7］。有研究报道［8-9］，Hcy与慢性肝病、肝脏脂质代谢紊乱、肝炎等的发生发展密切相关。同时，Hcy可以诱导肝细胞发生凋亡，但Hcy经过何种途径诱导凋亡的发生，其具体机制尚未清楚。

最近研究［10］发现，当细胞处于剧烈的化学刺激或者能量代谢失衡时，细胞内环境稳态将被破坏，内质网功能发生紊乱，主要表现为二硫键不能形成，引起蛋白质的错误折叠及蛋白质在内质网腔内积聚，最终导致细胞凋亡。梁平平等［11］研究发现成纤维细胞生长因子21（FGF21）在ERs诱导心肌细胞凋亡中具有保护作用，FGF21通过抑制内质网应激相关凋亡信号通路，减少心肌细胞凋亡。本文的研究结果表明，随着内质网应激水平的升高，肝细胞凋亡水平也随之升高，提示内质网应激反应与肝细胞凋亡之间存在着一定联系。

FoxO蛋白是在DNA结合域具有高度保守的翼状一螺旋结构的一类转录调控因子。FoxO1作为FoxO家族中最早被发现的成员，是调节细胞氧化应激反应及增殖、凋亡的重要转录因子［12-13］。有研究报道［14］，FoxO1在前列腺癌细胞中过度表达，会导致TRAIL表达增高，从而引起癌细胞凋亡增加。此外，FoxO1去磷酸化水平增高，引起FoxO1在肝星状细胞核中积累，从而促进了TRAIL诱导的细胞凋亡。本研究结果表明，肝细胞凋亡水平增高的同时，FoxO1 mRNA和蛋白表达水平均升高，反之，则相反。提示肝细胞凋亡可能受到FoxO1的调控，但其具体机制还有待进一步研究。

DNA甲基化是指在甲基化转移酶的催化下，DNA序列中的腺嘌呤（A）或胞嘧啶（C）碱基与甲基发生共价结合，并且可以在细胞分裂过程中传递给子细胞的表观遗传现象［15］。DNA甲基化在表观遗传学中发挥着重要的作用，虽然不改变核苷酸序列，却能调控基因的转录。启动子位置的DNA甲基化能抑制基因的转录，并且能与转录因子结合，导致染色质结构改变甚至是X染色体失活［16］。目前，DNA甲基化作为一种调控FoxO1表达的机制日益成为人们研究的热点，但是关于FoxO1基因DNA异常甲基化与肝细胞凋亡的相关性研究尚属于全新的领域，有待进一步探索。本文的研究结果表明，Hcy组FoxO1的DNA甲基化水平提高，同时FoxO1的mRNA与蛋白表达水平降低，提示FoxO1的表达水平可能受到DNA甲基化调控的影响。

综上所述，FoxO1启动子区DNA高甲基化参与了内质网应激反应，进而导致肝细胞凋亡，为进一步研究内质网应激反应导致肝细胞凋亡提供了新的实验依据。