肠道微生物与再生障碍性贫血的相关性研究

陈小玉 吴亮亮 周睿卿 许艳丽 李孔扬 张玉玲 王顺清

广州医科大学附属广州市第一人民医院血液内科（广州 510180）

人类肠道所携带的微生物种类繁多，从胃肠道样本中可检测出1 000多种肠道微生物，并且数量巨大，估计每个人的肠道微生物超过104个，约为人体细胞总数的10倍［1］。肠道微生物间有着微妙的平衡，打破这种平衡，将导致病理免疫反应和疾病的发生［2］。越来越多的证据表明，肠道微生物与疾病的发生有关。例如，与健康人对比，结直肠癌早期的志贺氏杆菌、枸橼酸杆菌属、沙门氏菌的比例更高［3］；克罗恩病患者中的拟杆菌门比例增加，厚壁菌门比例减低［4］；2型糖尿病患者中，厚壁菌门和梭菌纲所占比例明显降低，并且拟杆菌门/厚壁菌门的比值与血糖浓度呈正相关［5］。近年来，肠道微生物与疾病的关系已成为研究热点，但再生障碍性贫血（aplastic anemia，AA），由于发病率较低及取样困难，国内外尚未报道AA患者的肠道微生物变化情况。AA是一种可能由不同病因和发病机制引起的骨髓造血功能衰竭症，主要表现为骨髓造血功能低下、全血细胞减少和贫血、出血、感染综合征，免疫抑制治疗有效［6］。AA诊断标准：（1）全血细胞减少，网织红细胞百分数＜1%，淋巴细胞比例增加；（2）一般无肝、脾大；（3）骨髓多部位增生降低（＜正常50%）或重度降低（＜正常25%），造血细胞减少，非造血细胞比例增加，骨髓小粒空虚，且骨髓活检可见造血组织均匀减少；（4）除外引起全血细胞减少的其他疾病，如PNH、Fanconi贫血、Evans综合征等。虽然AA的发病机制至今仍不清楚，但随着研究的推进，免疫功能异常的理论被越来越多的学者所认同［7］。肠道微生物在维持宿主免疫内环境稳定方面发挥关键的作用，是免疫系统的调节器［8］。本研究探讨与对照组相比，AA患者是否存在肠道微生物异常改变。

1 对象与方法

1.1 研究对象本研究定义初诊AA患者为发病1个月内，未口服/静脉应用糖皮质激素或其他免疫抑制剂，未接受抗生素治疗的AA患者；否则为非初诊AA患者。选取2016年12月至2017年12月在广州市第一人民医院进行allo⁃HSCT治疗的48例AA患者进行检测分析，年龄（28.3±13.1）岁，男28例，女20例。其中12例为初诊AA患者，年龄（31.9±9.7）岁，男7例，女5例；36例为非初诊AA患者，年龄（27.1±13.97）岁，男21例，女15例。移植方式：亲缘人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）10/10全相合13例，亲缘HLA9/10相合1例，亲缘单倍体17例，非亲缘HLA10/10全相合10例，非亲缘HLA9/10相合7例。同时选取26例供者及10例健康人均无基础疾病及3个月内未使用任何抗生素，作为对照组，年龄为（29.4±13.5）岁，男22例，女14例。所有研究对象均签署知情同意书，经本院医学伦理委员会审批，认定本研究符合医学伦理标准。

1.2 试剂与仪器QIAamp DNA Stool Mini Kit购于德国Qiagen公司；无水乙醇购于广东汕头西陇化工公司；DNA BR购于英国Invitrogen公司；琼脂糖购于瑞士Lonza公司。-80℃冰箱购于美国Thermo公司；低温高速离心机购于德国Sigma公司；电热恒温水浴锅购于上海精宏实验设备有限公司；漩涡混匀器购于德国IKA公司；Qubit Fluorometer购于美国Life仪器；荧光定量PCR仪购于美国Applied Biosystems公司；Illumina HiSeq 2500购于美国Illumina公司。

1.3 样品收集收集48例AA患者以下两个时间点的粪便样品并依此分成两个研究组：（1）移植前组：allo⁃HSCT前2周，此时尚未预处理，除了小部分（31.3%）患者移植前合并感染需使用抗生素治疗外，大部分（68.7%）患者未接受抗生素治疗；（2）移植后组：移植后1个月，此时血常规大体恢复正常，AA的免疫紊乱和骨髓衰竭基本被纠正，无感染表现且无需使用抗生素治疗。其中有6例AA患者收集了移植后多个时间点的粪便样品进行检测，以期探讨其肠道微生物动态变化与AA移植后转归的相关性。另外择机收集对照组的粪便样品。

在样品收集后，新鲜的样品一开始储藏在4℃左右，24 h内分装在冷冻管里并在-80℃冻存直至使用。

1.4 DNA提取及测序称取200 mg粪便于2 mL EP管，具体操作步骤按照QIAamp DNA Stool Mini Kit（Qiagen，Germany）试剂盒的使用说明书进行。所有离心步骤应该在室温（15～25℃）、20 000×g（大约14 770 r/min）条件下进行：加入1.4 mL Buffer ASL，涡旋1 min，在95℃下加热5 min；涡旋15 s并离心1 min，吸取1.2 mL上清液到新的2 mL EP管中，弃去沉淀；加入Inhibit EX Tablet（吸附药片），涡旋1 min以上至药片全部悬浮，室温下孵化1 min；离心3 min，吸取200μL上清液到含有15μL蛋白酶K的1.5 mL EP管中；加入200μL Buffer AL，涡旋15 s，在70℃孵育10 min；加入200μL无水乙醇，涡旋混匀，得到裂解产物；把全部裂解产物涂抹在QIAamp纯化柱上，离心1 min；把QIAamp纯化柱放入新的2 mL收集管中，加入500μL Buffer AW1，离心3 min；把QIAamp纯化柱放入新的2 mL收集管中，加入500μL Buffer AW2，离心3 min；将QIAamp纯化柱放入新的1.5 mL EP管中，加入200μL Buffer AE，室温孵化1 min，然后离心1 min以洗脱DNA。提取后的DNA用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，并用Qubit Fluorometer检测DNA的浓度。

用通用引物515F（5′⁃GTGCCAGCMGCCGCGG⁃TAA）、806R（5′⁃GGACTACHVGGGTWTCTAAT）扩增细菌16SrRNA的V4可变区，其扩增产物在Illu⁃mina HiSeq 2500平台测序。测序下机数据经过数据过滤，滤除低质量的reads，剩余高质量的Clean reads方可用于后期分析；通过reads之间的Overlap关系将reads拼接成Tags；在97%的相似度下将Tags聚成 operational taxonomic units（OTU），然后通过OTU与Greengenes 16S参考数据库比对，对OTU进行物种门、纲、目、科、属和种水平的注释，基于OTU进行主成分分析和韦恩图分析；基于物种注释结果进行样品组间物种差异分析。

1.5 统计学方法采用SPSS16.0统计软件分析，正态分布的数据用均数±标准差表示，2组间数据比较采用t检验；非正态分布的数据用中位数表示，2组间数据比较采用Mann⁃WhitneyU检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 测序结果总共获得132个粪便样品，平均每个样品产生52 567条Tags，Tag平均长度为252 bp，共得到6 938 880条Tags，共产生1 385个OTU。

2.2 AA患者肠道微生物的主成分分析从主成分分析中可以看出对照组、移植前组和移植后组之间表现出分散的分布情况，说明这3组样品间物种组成有一定的差异（图1）。

图1 主成分分析Fig.1 Principal component analysis

2.3 AA患者肠道微生物的韦恩图分析在97%的相似度下，得到了每个样品的OTU个数，利用韦恩图可以展示多组样品共有和各自特有OTU数目，直观展示样品组间OTU的重叠情况。结合OTU所代表的物种，可以找出不同组间的共有微生物（图2）。

图2 韦恩图分析Fig.2 Venn diagram analysis

2.4 AA患者的肠道微生物变化图3展示了每个样品分别在门、纲、目、科、属、种水平的物种profiling柱状图，A1～A36为对照组样品；B1～B48为移植前样品；C1～C48为移植后样品。从图中可以直观看出不同物种在每个样品中所占的比例。移植前初诊AA患者组与对照组分别在门、纲、目、科、属和种分类水平中进行共有微生物的比较，发现除了科分类水平的毛螺菌科比较差异有统计学意义外，其他分类水平物种比较差异均无统计学意义；同样，在移植前非初诊AA组也是如此。因此随后本研究主要分析AA患者移植治疗前后毛螺菌科的变化情况。

在移植前，初诊AA组毛螺菌科相对丰度中位数为6.91%，比对照组毛螺菌科相对丰度（11.27%）降低（P=0.039）；非初诊AA组毛螺菌科相对丰度为7.31%，也比对照组毛螺菌科降低（P=0.010）；但初诊组与非初诊组之间毛螺菌科相对丰度比较差异无统计学意义（P=0.835）；于是将两组合并统称为移植前组，毛螺菌科相对丰度为7.20%，比对照组毛螺菌科降低（P=0.005）（图4）。

再来对比分析移植前后毛螺菌科的变化情况，移植后组毛螺菌科相对丰度为9.39%，与移植前组毛螺菌科相比，有上升趋势，但差异无统计学意义（P=0.658）；移植后组毛螺菌科相对丰度与对照组相比，差异也无统计学意义（P=0.061）（图5）。

图3 每个样品分别在门、纲、目、科、属、种水平的物种profiling柱状图Fig.3 The taxonomics composition distribution profiling histograms of each sample were shown at Phylum，Order，Class，Family，Genus，Species level separately

2.5 初步探讨再生障碍性贫血患者移植过程中毛螺菌科变化由图6可见4例allo⁃HSCT术后血象基本恢复正常的AA患者，毛螺菌科水平整体呈上升趋势，但在观察期间内尚未见到上升的平台期。2例allo⁃HSCT术后1个月血象基本恢复正常，毛螺菌科水平较移植前升高，但之后血象全面下降，DNA指纹图检查提示嵌合率下降，考虑出现继发性移植物排斥，同时毛螺菌科水平也明显降低（表1）。

图4 不同组间毛螺菌科的比较Fig.4 Comparison of Lachnospiraceaeamong different groups

图5 不同组间毛螺菌科的比较Fig.5 Comparison of Lachnospiraceaeamong in different groups

图6 移植后6例患者毛螺菌科的变化情况Fig.6 The changes of Lachnospiraceae in 6 patients after transplantation

表1 血象、嵌合率与毛螺菌科的动态变化Tab.1 The dynamic changes of bloodroutine,chimerismratioand Lachnospiraceae

3 讨论

肠道微生物现在被认为是人类最重要的微生态系统，其像一个器官，具备代谢、免疫和内分泌等多种生理功能，通过共同进化，宿主不仅可以耐受，而且还形成与微生物互惠互利的关系［9］。肠道微生物的相互作用是复杂的和流动的，能够适应每天遇到的生理扰动，然而，由于宿主的饮食、药物和其他环境因素的影响，肠道微生物群大量的或者有选择性的改变会扰乱微生物内部和宿主-微生物之间的关系，从而引发疾病的病理生理过程［10］。在这项研究中，与对照组的肠道微生物相比，初诊AA患者组和移植前组毛螺菌科的相对丰度降低。微生物的分类依据是生物在形态结构和生理功能等方面的相似性，根据微生物的分类，毛螺菌科属于厚壁菌门、梭菌纲、梭菌目。CD4+CD25+FOXP3+regulatory Tcell（Treg）细胞在肠道稳定状态时非常丰富，并且有助于维持肠道和免疫系统稳态。从健康人类粪便样品中分离出来的梭菌纲（包括毛螺菌科）会影响Treg细胞的数量和功能；在小鼠的动物模型中，口服梭菌纲菌株可以减轻小鼠结肠炎和过敏性腹泻的症状。最近有研究表明，毛螺菌科的相对丰度与Treg/Th17细胞数比值呈正相关，并且与CD4+T细胞内乙酰化组蛋白H3的中位荧光强度水平呈正相关，该研究推测毛螺菌科可能通过调节CD4+T细胞内乙酰化组蛋白H3水平，调控Treg/Th17的免疫平衡［11］。Treg细胞为具有免疫调节功能的T淋巴细胞亚群，其具有免疫抑制功能，参与多种自身免疫性疾病的病理生理过程。最近的研究表明，AA是一种由自身反应性T细胞介导的以攻击骨髓为主要靶器官的骨髓造血功能衰竭症，Treg细胞在AA的病理生理过程中发挥着至关重要的作用［12］。Treg细胞几乎在所有的AA患者中都是减少的，并且FOXP3的蛋白和mRNA水平及NFAT1的蛋白水平也是减少的甚至缺失的，低水平的NFAT1可能导致低FOXP3的表达；Treg细胞的缺失可以增强自身反应性T细胞的产生和AA的发展。AA患者外周血和骨髓中Treg细胞出现的频率均降低，因为CXCR4（而不是CXCR7）的低表达导致AA患者外周血Treg细胞的迁移能力受损，此外，AA患者Treg细胞抑制由效应T细胞产生的INF⁃γ的能力下降［12］。AA患者骨髓间充质干细胞由于TGF⁃β减少促使Treg细胞增殖缺陷，Treg细胞数量减少导致免疫内环境紊乱并进一步加剧骨髓衰竭［13］。有研究发现，AA患者血红蛋白计数与外周血Treg细胞表达呈正相关，即Treg细胞数量与AA患者贫血程度密切相关［14］。AA患者毛螺菌科的降低可能与Treg细胞的数量和功能相关，并且可能参与AA的病理生理过程。

本研究发现初诊AA患者与非初诊AA患者（即接受过免疫抑制、抗生素等治疗的患者）毛螺菌科相对丰度相比，差异无统计学意义。抗生素、免疫抑制剂等也许对毛螺菌科的影响较少，但本研究的病例数较少，还需更多的初诊AA患者进一步验证此猜测。经过allo⁃HSCT治疗1个月后，AA患者毛螺菌科水平虽然与移植前组相比差异尚无统计学意义（可能与样本量不足有关），但移植后毛螺菌科水平整体呈上升趋势，且与对照组毛螺菌科之间的差异无统计学意义。由图6可见allo⁃HSCT治疗后毛螺菌科水平整体呈上升趋势，且与移植后血象的动态变化相一致，即移植后血象稳定的患者毛螺菌科逐步上升，移植后血象下降的患者毛螺菌科也随之降低，但在本研究期间内，尚未见到毛螺菌科上升的平台期。

综上所述，毛螺菌科相对丰度的降低可能与AA相关，抗生素、免疫抑制剂等也许对毛螺菌科的影响较少，allo⁃HSCT术后AA的免疫紊乱和骨髓衰竭基本被纠正时，毛螺菌科水平整体呈上升趋势。毛螺菌科与AA之间的关系也许会导致对AA发病机制的新认识，今后可以扩大研究的病例数，进一步探讨造血干细胞移植过程中毛螺菌科的动态变化过程并寻找毛螺菌科恢复正常的时间点，同时评估AA患者毛螺菌科变化是否与Treg细胞，尤其是Treg/Th17的免疫平衡相关。