基于氧化应激调控的芪参颗粒干预心力衰竭大鼠的机制研究

曾紫凡 张惠敏 任莹璐 焦世红 王伟

摘要目的：探讨芪参颗粒干预心力衰竭大鼠的药效研究，并基于氧化应激探讨其作用机制。方法：制备左冠脉结扎诱导的心力衰竭大鼠模型，随机分为假手术组、模型组、芪参颗粒组、福辛普利组。通过苏木精伊红染色（HE）法、Masson染色分别观察各组大鼠心肌病理变化，并采用实时荧光定量PCR（RTPCR）和蛋白印跡（Western blotting）法分别检测大鼠心肌中氧化应激关键分子p47phox、RAC1的含量。结果：HE染色和Masson染色显示模型组大鼠心肌细胞排列紊乱，丧失正常结构，心肌间质出现大量炎细胞浸润，胶原过度沉积，纤维明显增生；而芪参颗粒与假手术组排列整齐，细胞形态基本无变化，几乎没有沉积的胶原蛋白。RTPCR和Western blotting显示模型组p47phox、RAC1在mRNA与蛋白层面显著增高；而芪参颗粒可显著降低p47phox、RAC1的含量。结论：芪参颗粒能显著改善左冠脉结扎诱导诱导的大鼠心力衰竭，其机制可能与抑制p47phox、RAC1诱导的氧化应激效应有关。

关键词氧化应激；芪参颗粒；心力衰竭；大鼠；调控；机制

Mechanisms of Qishen Granules on Heart Failure Rats by Regulating Oxidative Stress

Zeng Zifan1， Zhang Huimin1， Ren Yinglu1， Jiao Shihong2， Wang Wei1

（1 School of Chinese Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China；

2 School of Life Sciences， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

AbstractObjective：To study the effect and mechanisms of Qishen granules （QSG） on heart failure rats based on oxidative stress. Methods：Heart failure rat model was established by ligation of left coronary artery （LAD）. Rats were randomly divided into four groups including sham group， model group， QSG group and Fosinopril group. The pathological changes of heart were assessed by HematoxylinEosin （HE） and Masson′s staining. RealTime PCR and Western blot were respectively used to detect the mRNA and protein levels of p47phox and RAC1， the key molecules in oxidative stress in each group. Results：HE and Masson′s staining showed that the myocardial cells of rats in model group were disorderly arranged， and a large number of inflammatory cells were infiltrated in the interstitium. The collagen was excessively accumulated and the fibrous tissue was proliferated. On the contrast， the myocardial cells of rats in QSG and sham group were arranged in an order way and the collagen deposition was hardly observed. RealTime PCR （RTPCR） and Western blotting results showed that mRNA and protein levels of p47phox and RAC1 were increased in the model group， and QSG could significantly inhibit the expression of them. Conclusion：QSG may improve the heart function of heart failure rats induced by left anterior descending artery ligation， and its mechanisms is probably related to the inhibition of oxidative stress.

Key WordsOxidative stress； Qishen granules； Heart failure； Mechanism

中图分类号：R2855文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.05.045

心力衰竭（Heart Failure，HF）是多种心血管疾病的终末阶段，中医认为心力衰竭病大致归属于胸痹、心悸、水肿、等范畴，心力衰竭辨证又可分为寒凝证、血瘀证、痰浊证、阴虚证等[1]。在心力衰竭过程中，氧化应激水平不断增加，实验研究中也表明氧化应激的增加可能导致心脏结构和功能的改变，从而使心力衰竭患者病情加重。NADPH氧化酶依赖的超氧化物的产生是心脏氧化应激的最重要来源。在NADPH氧化酶的众多亚型中，Nox2型和Nox4型在心血管系统分布广泛且在心力衰竭中发挥重要作用。在终末期心力衰竭患者心肌NADPH氧化酶活性增加[2]；在急性心梗患者和大鼠梗死区心肌细胞Nox2的表达显著升高[34]；Nox2/小鼠左冠脉前降支结扎术后4周心肌肥厚、凋亡、间质纤维化以及心功能等方面均优于野生型小鼠，进一步表明Nox2是心梗后心力衰竭氧化应激的重要参与因素[5]。Nox2型的NADPH氧化酶主要位于细胞膜，由膜结合的Nox2（gp91phox）和p22phox亚基组成，但是其活化需要p67phox、p47phox、p40phox、RAC1参与组成完整的酶复合体[6]。其中，p47phox的磷酸化及易位和RAC1的易位在酶复合物的组装和激活过程中发挥着重要作用[7]。

芪参颗粒是由黄芪、丹参、金银花等中药组成的复方制剂。前期研究[8]发现，芪参颗粒具有心肌保护作用，且该药物能针对于Nox2型NADPH氧化酶有效的改善心力衰竭大鼠的心功能。本实验意在进一步研究芪参颗粒对心力衰竭大鼠心脏中p47phox和RAC1的影响，探讨其抗氧化应激的作用机制。

1材料与方法

11材料

111动物SPF级正常雄性SpragueDawley（SD）大鼠90只，体重（220±10）g。购于北京维通利华实验动物中心。适应性喂养1周，恒温，恒湿，自由饮水，普通饲料。

112药物芪参颗粒由黄芪、丹参、金银花、甘草等6味中药组成，各药材饮片均购于北京同仁堂制药有限公司，按照课题组前期建立的方法制备[9]。福辛普利由中美上海施贵宝制药有限公司提供，国药准字H19980197。

113试剂与仪器TRIzol（Ambion，Thermo Scientific，美国），逆转录试剂盒（Thermo Scientific，USA，lot number：K1622），FastStart Universal SYBR Green Master（Roche，Germany，lot number：04913914001），引物（生工生物工程股份有限公司，上海），RIPA裂解液（普利莱），蛋白酶抑制剂（Roche，Germany，lot number：04693116001），蛋白磷酸酶抑制剂（Roche，Germany，lot number：04906845001），Rac1（antiRac1 antibody，ab33186，Abcam，1：500）phosphoRac1（antiphospho Rac1 antibody，ab203884，Abcam，1：500）；p47phox（antip47phox antibody，ab795，Abcam，1：500）；phosphop47phox（antiphosphop47phox antibody，PA536773，Thermo Fisher Scientific，1：500）

12方法

121分组与模型制备90只SPF级SD大鼠常规饲料饲养，自由饮水。适应性饲养1周后，按照体重随机分为模型组75只和假手术组15只。模型组进行左冠脉结扎（LAD），术后进行心电图检测，大鼠心电图标准12导联中出现6～8个导联Q波的模型组大鼠纳入研究范围。

122干预方法将其中35只造模成功大鼠随机分为3组，实验终末存活大鼠为：模型组10只，QSG组8只和福辛普利组6只。10只假手术组动物除穿线不结扎外，其余同模型组。QSG组为等量临床等效剂量的两倍（1866 g/kg）；西药组给予福辛普利钠片467 mg/kg，均以水溶方式每天灌胃给药，灌胃体积为10 mL/100 g；假手术组和模型组动物给予同体积生理盐水，连续给药28 d后，摘取心脏，留取心脏组织进行HE与Masson染色。

123检测指标与方法

1231荧光定量PCR（RealTime PCR，RTPCR）法检测的p47phox、RAC1表达Trizol法在冰上提取细胞总RNA逆转录逆转录为cDNA。实时定量荧光PCR；2-△△Ct法分析mRNA相对表达量。引物序列见表1。

1232Western blotting法检测蛋白含量RIPA裂解缓冲液提取总蛋白；BCA法蛋白定量；蛋白上样量50 μg/10 μL，电压80～120 V，电泳1～15 h。将凝胶上的蛋白电转移至NC膜，以5%脱脂奶粉37 ℃封闭1 h，一抗与膜封入杂交袋4 ℃过夜。TBST漂洗NC膜3次，10 min/次；取出NC膜加入二抗，常温孵育1 h，TBST洗膜3次后，滴上ECL发光液，曝光。记录每条蛋白泳带的灰度值进行定量分析。

13统计学方法采用SPSS 200软件进行统计分析，所有结果均以均数±标准差（±s）表示。数据符合正态分布者采用方差分析法进行多组间比较，反之采用非参数检验方法分析，以P<005为差异有统计学意义。

2結果

21病理切片HE染色结果：LAD后，假手术组心肌细胞完整，排列整齐，细胞形态基本无变化；模型组大鼠心肌细胞排列紊乱，心肌间质出现大量炎细胞浸润，丧失正常结构。而芪参颗粒组心肌细胞形图1各组大鼠心肌组织病理切片HE（A）与Masson染色（B）（×400）

态均匀，较少发生炎细胞浸润，与阳性药福辛普利组一致。Masson染色结果：光镜下观察，假手术组在心肌细胞中几乎没有沉积的胶原蛋白；而模型组心肌胶原过度沉积，纤维明显增生，呈网格状包绕心肌细胞。芪参颗粒组与阳性药组可显著减缓胶原沉积于纤维增生过程。

22实时定量荧光PCR检测的p47phox、RAC1的mRNA表达与假手术组比较，模型组p47phox、RAC1的mRNA表达升高；与模型组比较芪参颗粒组能降低心肌组织中p47phox、RAC1的mRNA表达显著降低，与福辛普利组作用相似。

注：与模型组比较，**P<001；与模型组比较，***P<0001；与正常组比较，△△P<001；与正常组比较，△△△P<0001

图3Western blotting法检测各组小鼠心肌组织中

pp47phox、p47phox、pRAC1、RAC1蛋白含量

注：与模型组比较，*P<005；与模型组比较，**P<001；与正常组比较，△P<005；与正常组比较，△△P<001

23Western blotting检测pp47phox、p47phox、pRAC1、RAC1的蛋白表达模型组较假手术组pp47phox、pRAC1蛋白表达明显升高，总p47phox、RAC1蛋白无明显变化。治疗后芪参颗粒组和福辛普利组的pp47phox、pRAC1蛋白表达均有下降且与模型组比较，差异有统计学意义。

3讨论

心力衰竭是心血管系统疾病中的常见病，是多种器质性心脏病患者终末阶段时心脏功能代偿失调的综合征。随着对心力衰竭疾病病理过程认识的不断进步，西医对心力衰竭的治疗从短期地纠正血流动力学异常，逐步转变为长期地调控神经体液乃至试图逆转心肌异常着手。从“强心、利尿、扩血管”的心力衰竭常规治疗转变为“ACEI、利尿剂、β受体阻滞剂的联合应用，并用或不用地高辛”。前者可以迅速缓解呼吸困难、水肿等症状，提高心功能；而ACEI、β受体阻滞剂治疗则可促使心力衰竭病死率的下降。

虽然西医治疗心力衰竭已取得可喜的进展，但扔存在安全系数低、适应范围窄、不良反应较大等问题[10]。中医药采用益气温阳、活血利水等方法能够减轻心力衰竭患者症状、提高生命质量。芪参颗粒是本团队治疗心力衰竭的效方，以温阳益气、活血解毒配伍为特色，前期研究[11]表明该方可有效改善心力衰竭大鼠心功能，调控NADPH氧化酶活性，干预氧化应激。本研究以NOX2型NADPH氧化酶活性为切入点，通过建立大鼠LAD模型，采用心脏病理切片技术、定量荧光PCR法及western blotting的检测技术，首次研究芪参颗粒对NOX2下游的p47phox、RAC 1基因和蛋白进行定量研究。

通过本研究可以明确的结论有芪参颗粒可显著提高LAD大鼠的心功能，减缓LAD大鼠心肌细胞结构改变程度，抑制心肌胶原过度沉积与纤维增生。p47phox、RAC1在模型组心肌细胞内的表达较假手术组升高即心力衰竭的确会促进氧化应激的发生这一点与国内外的研究结论一致。芪参颗粒用药4周后对p47phox和RAC1表达的确有影响，并与福辛普利作用相似，即调控氧化应激是芪参颗粒心肌保护作用的机制之一。

仍需进一步研究的问题：首先，我们没有检测不同剂量水平芪参颗粒对氧化应激的影响，所以剂量和效果之间的关系还有待进一步研究。其次，虽然芪参颗粒在我们以往的研究中的成分相对清晰，但有效成分和靶点之间的直接关系尚不清楚。最后，我们这次只关注芪参颗粒在LAD模型动物中p47phox、RAC1表达情况。为了阐明整体情况，芪参颗粒对心力衰竭的其他模型，如主动脉弓缩窄术模型、过量异丙肾上腺素致大鼠心力衰竭模型等都需要验证。在后续实验中本课题组在已有实验结论的基础上进一步会根据不同的模型进行多方位的验证探索芪参颗粒改善心功能的作用。

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