双峰驼驼乳中血清白蛋白的 分离纯化及其结构表征

郭 雁,明 亮,伊 丽,伊日贵,高婉婷,吉日木图,2,*

(1.内蒙古农业大学,乳品生物技术与工程教育部重点实验室,内蒙古呼和浩特 010018; 2.内蒙古骆驼研究院,内蒙古阿拉善 750306)

内蒙古优越的气候地貌和植物资源为我国特有种群双峰驼提供了良好的生存环境和条件。与其他畜牧牲畜相比,双峰驼具有极高的农业和食品经济价值。双峰驼驼乳作为荒漠、半荒漠地区的重要奶源之一,营养丰富,易于消化吸收,且乳中蛋白组分具有很好的生物医药应用前景[1-5]。

血清白蛋白(Serum albumin,SA)是乳中重要的蛋白组分,含量为(8.5±3.58) mg/mL,其分子量相对较大,大约为70 kDa并带有负电荷[6-8]。SA通常由肝脏合成,在动物体内参与运输脂肪酸、类固醇激素、氨基酸以及胆色素等物质。SA含有多个配体结构域,能够与代谢物、维生素、金属离子及药物等结合,在血液循环中可作为许多内源性和外源性物质的存储和转运载体。血管内的SA在维持血浆胶体渗透压方面也起到重要作用,可调节机体的水电平衡和酸碱平衡[9-11]。

目前对SA的研究主要集中在单峰驼[12-13]及异源动物上[14-15],如牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)和人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA),对双峰驼血清白蛋白(Camel serum albumin,CSA)特别是双峰驼驼乳中CSA的研究相当匮乏。因此本研究拟从双峰驼驼乳中分离CSA,并对其氨基酸序列、分子量、等电点、氨基酸组成及二级结构进行分析,旨在综合开发利用双峰驼驼乳及双峰驼驼乳蛋白,并为探究CSA与其他动物SA的差异与优势奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

驼乳 内蒙古阿拉善盟健康双峰母驼6峰,分别挤奶后混合乳样,采集后置于-80 ℃保存;预染蛋白Marker(10～170 kDa) 美国Thermo Fisher Scientific公司;SDS-PAGE预制胶(15%分离胶、5%浓缩胶) 江苏南京金斯瑞生物科技有限公司;等点聚焦标准物 美国GE公司;两性电解质 美国Bio-Lyte;二辛可宁酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司;异硫氰酸苯酯(PITC)、乙腈 美国Sigma公司;所有试剂 均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 驼乳预处理 驼乳在4 ℃下解冻。解冻后于4 ℃,5000 r/min,离心30 min。弃去上层脂肪,即得脱脂乳。脱脂乳在室温下用1 mol/L的HCl溶液调至pH为4.3,40 ℃水浴20 min,8000 r/min离心20 min(4 ℃),收集上清液(乳清)[16-17]。将收集的上清液用0.22 μm针头滤器过滤,-20 ℃保存备用[6]。

1.2.2 离子交换层析分离CSA 采用DEAE-FF层析柱(16 mm×25 mm),用20 mmol/L Tris-HCl 缓冲液(pH8.4)平衡层析柱直至紫外吸收基线、电导稳定[18]。将过滤后的乳清蛋白样液加入DEAE-FF层析柱,用20 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.4)洗脱。待紫外(UV)值较稳定,用含0.1～0.4 mol/L NaCl的20 mmol/L Tris-HCl 缓冲液(pH8.4)进行线性洗脱[19]。洗脱速度60 mL/h,280 nm下自动检测并记录。收集洗脱峰,-20 ℃保存备用，BSA标准品为对照。

1.2.3 凝胶层析纯化CSA Sephacryl S-100层析柱(16 mm×60 mm)用20 mmol/L Tris-HCl 缓冲液(pH8.4)平衡至基线稳定。将DEAE-FF层析柱收集的洗脱液上样进行二次纯化。洗脱速度30 mL/h,280 nm下自动检测并记录,收集洗脱峰,-20 ℃保存备用。

1.2.4 CSA纯度的鉴定 采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法。将层析收集所得的蛋白质洗脱峰,用SDS-PAGE凝胶电泳对所纯化蛋白组分进行鉴定[20-21]。所用分离胶浓度为15%,浓缩胶浓度为5%。起始恒定电压为90 V,时间约为30 min。进入分离胶后,恒定电压120 V,时间约2 h。当染料(溴酚蓝)距底边1 cm时,停止电泳。经考马斯亮蓝染色,脱色液脱色,将凝胶放入凝胶成像仪中成像。

1.2.5 氨基酸序列覆盖率分析 参考Nagarj等[22]和Thakur[23]的方法,将纯化后CSA经胰酶酶解后,采用高相液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)对CSA进行氨基酸序列分析。通过质谱分析和数据库检索实现对CSA的鉴定。

1.2.6 CSA结构表征

1.2.6.1 CSA分子量的测定 采用液质联用LC-MS高分辨质谱对CSA的相对分子量进行分析[24-25]。将一定量CSA加入0.1%甲酸水中,调节pH至2～3之间,离心(3000 r/min,10 min)取上清;用BCA试剂盒以BSA为标准品测定上清中蛋白浓度,并用0.1%甲酸水稀释样品浓度至0.1 μg/μL进行上机检测。

高效液相色谱条件:色谱柱为MAbPac RP,Analytical(0.3 mm×150 mm),采用0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B)流动体系,分析时间为20 min,流速200 μL/min,梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

质谱条件:采用IDA采集模式,一个MS1图谱选择40个最强的母离子进行串级扫描,质谱扫描范围800～4000 m/z。

1.2.6.2 CSA等电点的测定 参照杨宇峰等[26]的方法,采用等电聚焦电泳法测定样品的等电点。将一定量CSA进行超滤脱盐处理,随后选用适当的超滤管超滤浓缩,再以1%甘氨酸进行置换超滤清洗。将置换后样品和对应的标准品至上样孔,按照电压500 V,电流50 mA,功率为每1 cm凝胶1 W的电泳条件,电泳20 min,之后设置电压2000 V,电流50 mA,功率为每1 cm凝胶1 W,再电泳90 min后停止。经染色,脱色后转移至扫描仪进行图像扫描,并用Image Quant TL Version 7.0软件分析样品的等电点。

1.2.6.3 CSA氨基酸组成分析 通过异硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生法测定CSA水解物中游离氨基酸以确定氨基酸组成[27]。

将CSA在6 mol/L HCl条件下水解成游离氨基酸,然后用PITC对游离氨基酸进行衍生化处理,处理完毕后,以18种氨基酸为标准品,在同等高效液相色谱条件下，对衍生化的氨基酸样品对应的保留时间进行分析,并计算各氨基酸的含量。

高效液相色谱条件:流动相A液为0.05 mol/L乙酸钠水溶液,B液为甲醇乙腈水溶液(甲醇∶乙腈∶水=20∶60∶20(V∶V∶V)),流速1.0 mL/min,柱温35 ℃。色谱柱以95%的A液平衡后,样品由自动进样器上样到氨基酸分析柱Diamonsi AAA(250 mm×4.6 mm)。梯度洗脱程序见表2。

表2 梯度洗脱程序Table 2 Gradient elution program

1.2.6.4 CSA圆二色谱分析 将纯化的CSA溶液置于超滤管中,利用反复浓缩的方法使20 mmol/L Tris-HCl 缓冲液(pH8.4)替换为20 mmol/L PB缓冲液(pH8.0)。根据仪器响应水平将蛋白质量浓度浓缩为0.2 mg/mL,以20 mmol/L PB缓冲液(pH8.0)作为空白对照[28-29]。

圆二色谱条件:波长扫描范围为190～250 nm,步长1.0 nm,扫描速度50 nm/min,检测环境为室温。扫描后圆二色谱图利用Jwstda32软件对样品二级结构进行拟合计算。

1.3 数据处理

数据采用SPSS 18.0软件分析,结果表示为平均值±标准差(S)的形式,n=3。

2 结果与分析

2.1 驼乳乳清蛋白阴离子柱层析分离

驼乳乳清蛋白的DEAE-FF离子交换层析洗脱曲线见图1。由图1可知,在280 nm紫外检测仪在线检测条件下得到5个洗脱峰,其中用20 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.4)洗脱得到3个洗脱峰,即峰Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ;待UV值较稳定后,采用含有0.1～0.4 mol/L NaCl的20 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.4)进行线性洗脱得2个洗脱峰,即峰Ⅳ,Ⅴ。收集上述洗脱峰并通过SDS-PAGE凝胶电泳，对DEAE-FF离子交换层析所得的蛋白组分进行分析,结果如图2所示,以BSA为标准品进行对照可知,洗脱峰Ⅴ中有目的蛋白CSA被洗脱出,该洗脱峰所对应的NaCl浓度为0.24 mol/L左右。由于SDS-PAGE凝胶图(图2)中蛋白条带Ⅴ中还存在多条杂蛋白带,因此需对该峰的洗脱液进行二次纯化。

图1 乳清蛋白的DEAE-FF离子交换层析图Fig.1 DEAE-FF chromatographic fractionation of camel’s milk whey

图2 驼乳乳清蛋白离子交换层析后 各收集峰的SDS-PAGE电泳图Fig.2 SDS-PAGE electrophoretic analysis of the purified camel whey proteins 注:Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ和Ⅴ表示分别对应图谱中的洗脱峰Ⅰ～Ⅴ； M表示蛋白质分子质量标准(15～170 kDa)。

2.2 凝胶层析纯化结果与分析

对离子交换柱分离所得的含有CSA的洗脱峰Ⅴ,用聚丙烯酰胺葡聚糖Sephacryl S-100进行进一步纯化,经Sephacryl S-100柱层析分离纯化后,其层析图谱见3。由图3可知,洗脱峰Ⅴ经Sephacryl S-100纯化后,获得2个洗脱峰(Ⅰ和Ⅱ)。收集上述洗脱峰并通过SDS-PAGE凝胶电泳进行组分分析及纯度鉴定,结果如图4所示,Sephacryl S-100层析洗脱峰Ⅱ对应的SDS-PAGE凝胶电泳蛋白条带分子量约为70 kDa,且该蛋白条带明显且单一,基本无杂蛋白,因此可初步确认该组分为目的蛋白CSA,且纯化效果较好。通过蛋白凝胶图对样品的纯度进行分析可知,经二次纯化后目的蛋白CSA纯度在95%以上,纯度结果表明本试验所采用的方法是有效的,可行的。此外,在分离过程中缓冲液盐浓度较低,从而避免了蛋白质的变性降解,保证了CSA后续结构表征的分析研究。

图3 Sephacryl S-100凝胶层析纯化图Fig.3 Sephacryl S-100 gel chromatographic fractionation

图4 Sephacryl S-100凝胶柱层析 收集峰的SDS-PAGE电泳图Fig.4 SDS-PAGE electrophoretic analysis of the purified CSA.注:M表示蛋白质分子质量标准(15～170 kDa), Ⅱ对应Sephacryl S-100层析图谱中洗脱峰Ⅱ。

2.3 氨基酸序列分析

LC-MS/MS检测结果如图5所示,其中黑色粗体标记的序列为实际检测到的肽断。经NCBI数据库检索分析表明，样品CSA的氨基酸序列与野骆驼的氨基酸序列(NCBI:XP_006188754)有较高的相似度,蛋白氨基酸覆盖率为89%,两者具有同源性。该结果说明纯化蛋白为目标蛋白CSA,满足后续试验要求。

图5 CSA/NCBI数据库XP_006188754序列覆盖度图 Fig.5 Database amino acid sequence of CSA(NCBI accession no. XP_006188754)was compared with the purified protein注:Carbamidomethylation表示半胱氨酸残基的固定修饰物,Oxidation为被氧化的蛋氨酸。

2.4 CSA分子质量的确定

通过LC-MS质谱对提纯后CSA进行分析,可得该样品溶液的总离子流色谱图(图6)及质谱图(图7)。其中总离子流色谱图仅有1个主峰,其保留时间为9.246 min;其余色谱峰由于在样品溶液中浓度较低其峰不明显,如:保留时间为0.542、2.983、5.318 min所对应的色谱峰。

图6 CSA溶液总离子流图(TIC)Fig.6 Total ion chromatography of CSA in camel milk

图7 CSA溶液质谱图Fig.7 Mass spectrum diagram of CSA solution

利用色谱图面积归一化法定量分析,可知CSA所对应的色谱峰即为图6中的主峰。因此选取保留时间在9.236 min时的质谱图(图6)为研究对象,通过Bio Pharma Finder 2.0软件将质谱图(图7)中多电荷峰解卷积,得到解卷积谱图(图8),分析计算得CSA分子量为66490.17 Da。该分子量与之前报道的单峰驼CSA、BSA和HSA分子量基本保持一致[12,30-31]。

图8 CSA溶液质谱解卷积图Fig.8 Deconvolution diagram of CSA solution

2.5 CSA等电点的确定

通过等电聚焦电泳法对CSA等电点进行分析,CSA和等电点标准品等电聚焦电泳图如图9所示。将扫描后胶图(图9)采用Image Quant TL Version 7.0软件分析CSA的等电点,计算得CSA等电点pI为4.48。这与已报道的BSA等电点4.70,HSA等电点4.90相近[32-33]。

图9 驼乳中CSA等电聚焦电泳图Fig.9 IEF of CSA in camel milk注:M-pI表示IEF等电点标准(4.45～9.6 kDa)。

由于蛋白质是由氨基酸组成的,因而蛋白质分子所含的碱性氨基酸和酸性氨基酸的数目直接影响其在溶液中所带的电荷,即影响其等电点[34-35]。根据上述计算结果可知CSA等电点偏酸性,因此CSA蛋白质分子中含有较多酸性氨基酸。

2.6 CSA氨基酸组成分析

本文采用异硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生法对CSA氨基酸组成进行研究。样品CSA水解后的游离氨基酸样品经PITC衍生化处理后,经过高效液相色谱LC-20AT设备分析,得到的图谱经Labsolution软件积分标峰,所得的标峰图谱见图10,数据处理积分结果见表3。从表3可知,CSA氨基酸除色氨酸(Trp)外,富含17种氨基酸,其中人体必需氨基酸占氨基酸总量的47.36%;氨基酸组成中含量最高的是谷氨酸(Glu),占总氨基酸含量的12.41%,其次是亮氨酸(Leu)占总量的12.3%。由于实验前对CSA进行酸水解处理,天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)分别转化为天冬氨酸(Asp)和谷氨酸,故将前者与后者理论个数合并计算;色氨酸在酸水解过程中吲哚环被破坏,因此表3中色氨酸含量无相应数据提供。

表3 驼乳中CSA氨基酸组成含量Table 3 Amino acid composition of CSA in camel milk

图10 驼乳中CSA氨基酸组成液相色谱图谱Fig.10 HPLC chromatogram of amino acid composition of CSA in camel milk

参考孙军勇[36]的报道可知，谷氨酸和天冬氨酸的流水值为零，属于亲水性氨基酸。丝氨酸疏水值为-0.3，是亲水性最强的氨基酸。由表3可得，CSA中疏水性氨基酸含量较高，占总量的71.64%。

为了进一步分析CSA的营养价值,依据FAO/WHO/UNO人体必需氨基酸推荐值,从表3可以看出,CSA所含有的必需氨基酸含量均能够满足成人需求,而含硫氨酸(蛋氨酸(Met)和半胱氨酸(Cys)含量不能满足儿童的需求,这可能与蛋氨酸或半胱氨酸在酸性条件下易损失相关。

2.7 CSA的圆二色谱分析

圆二色谱(CD谱)在远紫外区(185～245 nm)的扫描图谱,反映的是蛋白质主链的构象。计算所得的是蛋白质二级结构比例,即α-螺旋(α-helix)、β-折叠(beta-sheet)、转角(turn)和不规则卷曲(random coil)的比例。其中α-螺旋在192 nm附近有1个正峰,在207～210和221～222 nm处有2个负峰;β-折叠在185～200 nm附近有1个正峰,在217～218 nm附近有1个负峰;β-转角的极值波长在205 nm附近有1个正峰,在220～230 nm附近有1个弱信号负峰,在180～190 nm附近有1个强信号负峰;而无规卷曲在220 nm附近有1个正峰,在200 nm附近有1个负峰[37]。

CSA在远紫外区的圆二色谱图见图11。如图11所示,CSA在192 nm处有1个正峰,在208,222 nm 处呈两个负的特征肩峰,说明CSA中含有α-螺旋和β-折叠,可见CSA是一种α+β型蛋白。该分析结果与Michael Dockal报道的HSA二级结构型一致[38]。基于CD谱摩尔椭圆率(θ),采用Jwstda32软件对样品CSA与软件自带的标准二级结构曲线进行拟合计算,得到CSA的二级结构比例。其中α-螺旋所占比例最高为51.1%,其次是不规则卷曲19.8%和β-转角14.8%,β-折叠含量最低8.5%。该测定结果不仅补充了对CSA性质研究的空白,也为CSA的分析和鉴定提供了新的光谱鉴定依据。除此之外,有文献报道BSA二级结构组成比重中α-螺旋为54.5%[39],HSA中α-螺旋含量为46.6%[40],其中CSA,BSA 所含有的α-螺旋结构明显高于HSA,因此CSA,BSA主链走向(结构)较HSA稳定。

图11 驼乳中CSA的CD图谱 Fig.11 Circular dichroism spectrum of CSA in camel milk

3 结论

本研究根据双峰驼驼乳中CSA的特性,采用离子交换层析,凝胶过滤层析分离纯化CSA,并通过SDS-PAGE凝胶电泳,氨基酸序列分析对所纯化蛋白质进行纯度分析及鉴定。其中SDS-PAGE凝胶电泳经考马斯亮蓝染色后胶图显示单一条带,经分析得该蛋白条带为目的蛋白CSA且其纯度在95%以上,提纯效果好,随后氨基酸序列分析结果显示,CSA氨基酸序列与野骆驼中CSA的氨基酸序列覆盖率高达89%,两者具有同源性,确定纯化蛋白为CSA。随后对CSA的结构进行解析,结果表明,CSA相对分子量为66490.17 Da,等电点为4.48,谷氨酸含量最高(12.41%),是一种营养丰富的优质蛋白质。经过圆二色谱测定CSA二级结构,判定其符合α+β型蛋白且在一定条件下结构更稳定。