乙酰肝素酶介导心肌细胞凋亡的研究

曹洪帅　韩轩茂

[摘要]目的研究硫酸乙酰肝素酶（HPSE）对心肌细胞缺氧/复氧损伤后细胞凋亡的影响作用。方法体外培养H9C2心肌细胞，复制心肌细胞缺氧/复氧模型，模拟心肌缺血/再灌注损伤（MIRI）。实验分为正常对照组（C组）、缺氧/复氧组（H瓜组）、HPSE抑制剂处理组（OGT2115组）等三组。形态学观察细胞状态，MTT法检测H9C2心肌细胞存活率。结果与对照组相比，H/R处理后心肌细胞存活率显著降低（P<0.05）；与H瓜组比较，OGT2115处理后可提高缺氧/复氧后H9C2心肌细胞存活率（P<0.05）。结论HPSE抑制剂对缺氧/复氧后H9C2心肌细胞凋亡有抑制作用，拓宽HPSE阻滞剂临床应用范围，具有重要的基础及临床意义。

[关键词]心肌细胞；缺氧复氧损伤；乙酰肝素酶

[中图分类号]R542.2 [文献标识码]B [文章编号]ISSN.2095-6681.2018.05.125.02

硫酸乙酰肝素酶（HPSE）是一种内切性β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶，是哺乳动物细胞中唯一可以切割细胞表面的硫酸乙酰肝素侧链的酶，参加细胞外重塑。HPSE涉及多种生理过程如胚胎植入，组织修复和炎症过程；病理致病过程主要包括肿瘤的进展和肾脏疾病。研究表明，HPSE在多种恶性肿瘤病理发展过程中呈现高表达、高活性状态，有可能成为一个抗肿瘤治疗的新靶点。HPSE作为一个新的靶向治疗位点正在逐渐被人们所认识。近期发现，HPSE在大鼠缺血再灌注损伤（I/R）模型中有影响作用，但迄今为止，尚未见缺血过程中心肌细胞自身HPSE表达、调控及凋亡的研究报告。本实验通过培养H9C2心肌细胞，复制缺氧/复氧损伤模型，模拟临床上MIRI，并用HPSE抑制剂进行干预，进而探讨HPSE对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤后的影响作用。

1资料与方法

1.1实验药物

OGT2115

1.2细胞

H9C2心肌细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司）

1.3试剂

DMEM高糖培养基，胰酶，PBS，胎牛血清，MTT粉末，青霉素链霉素混合液，DMSO。

1.4儀器

C02培养箱，荧光倒置显微镜，酶标仪。

1.5方法

1.5.1细胞培养

配置培养基：10%胎牛血清（BSA）、1%青霉素链霉素混合液的DMEM培养基。培养H9C2心肌细胞，置于常规培养箱培养，待细胞生长80%满时，进行细胞传代，2～3天传代1次，用于后续实验。

1.5.2复制H9C2心肌细胞缺氧/复氧模型

细胞生长80%满后，将细胞的培养基换成PBS，置于缺氧装置中孵育4h（缺氧时间超过时，许多调亡细胞团漂浮于培养基中，易造成极大误差，因此本实验细胞缺氧时间定为4h），缺氧处理后更换含10%BSA的DMEM培养基，置于常规培养箱中培养3 h，模型建立完成。

1.53形态学观察

在高倍显微镜下观察细胞的状态，可以通过观察细胞状态大致判断细胞存活情况。

1.5.4MTT法检测细胞凋亡

取对数生长期的H9C2心肌细胞，以5×103/孔的密度接种于96孔板中，细胞贴壁后，试验组分别加入不同浓度OGT2115（20、40、60、80、100μg/mL）。每组设4个复孔。试验组和模型组缺氧培养4 h后，换为10%胎牛血清的DMEM培养基孵育箱孵育3个小时，对照组不进行缺氧复氧操作。操作完成后，三组细胞每孔加入20μL的MTT液体（避光），放回细胞孵箱，孵育4h，终止培养，小心吸去全部培养液。每孔加入DMS0150 μL，振荡5～10 min，使结晶物充分溶解。酶联免疫检测仪在490 nm波长检测每孔吸光度值。实验重复3次。

2结果

2.1形态学

正常状态下H9C2心肌细胞呈梭形贴壁生长，细胞周边颜色透亮有光泽。衰老死亡的细胞呈球形且不贴壁悬浮于细胞培养液中，通过细胞形态学对比可以看出HPSE抑制剂处理后可以明显降低细胞凋亡率。

2.2 MTT法检测细胞凋亡

MTT法检测结果（表1）显示，正常对照组心肌细胞存活率97.00±2.34%，H/R模型组为42.91±5.33%，H/R实验组为60.24±7.61，缺氧处理后H9C2细胞的相对增殖率明显下降（P<0.05）。HPSE抑制剂处理后，H9C2细胞的相对增殖率升高（P<0.05）。

3讨论

心肌细胞凋亡与大部分心血管疾病的发生发展密切相关，大量研究表明，在众多心脏疾病中如心力衰竭、心肌梗死等都存在心肌细胞凋亡形态学的改变。心肌细胞凋亡在MIRI发生发展中发挥着重要作用。有资料显示，I/R是急性肾衰竭和延迟移植功能的重要原因，可通过激活肾小管细胞的上皮至间质转化（EMT）而诱导慢性肾损伤，HPSE在其中可能具有重要的作用。本实验证实了HPSE抑制剂在缺氧复氧诱导H9C2心肌细胞凋亡过程中起保护作用。我们课题组借助乙酰肝素酶及其相关因子在白血病中表达水平的研究经验，采用多种研究方法，研究患者全身及血小板HPSE与心肌缺血再灌注的相关性；重点研究HPSE对心肌细胞的纤维化和凋亡的影响，探讨HPSE在心肌缺血再灌注损伤发病中的作用，及可能的分子机制，为今后心衰的监测、治疗及预后评估开辟新方向，拓宽在其他领域中，HPSE阻滞剂临床应用范围，具有重要的基础及临床意义。

本文编辑：李豆