高脂饮食诱导肥胖对小鼠缺血性脑损伤的影响①

张继红，马存根

山西大同大学医学院，山西大同市037009

长期食用高脂肪饮食引起的肥胖是急性缺血性脑卒中的独立危险因素[1-2]。最近研究提示，肥胖与2型糖尿病、高血压、神经退行性疾病、脂质紊乱和认知障碍等相关[3-4]。肥胖是缺血性脑血管病患者功能恢复较差和死亡率增加的独立预测因子[5]。在脑卒中中，新生血管的生成具有神经保护作用，但在高脂饮食诱导2型糖尿病小鼠中，血管生成过多导致外周并发症[6]。

Wnt蛋白是细胞因子分泌的糖蛋白，可调节神经细胞增殖和分化，在成人中枢神经系统发展中起重要作用。Wnt信号激活为新生神经元向缺血损伤部位神经细胞的分化和迁移提供了一个合适的环境，有助于功能恢复。此外，抑制Wnt信号可减少啮类动物神经元的形成，并损伤其识别能力[7-8]。在本研究中，我们探讨肥胖对小鼠脑缺血性损伤后功能恢复的影响。此外，我们还检测在脑卒中损伤和修复中发挥关键作用蛋白质的表达，如去乙酰化酶(sirtuin,Sirt1)、Wnt和凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)等。

1 材料与方法

1.1 实验动物

60只雄性C57BL/6小鼠(8～10周)，购于山西医科大学，动物许可证号SCXK(晋)2009-0001，体质量20～25 g。小鼠存放在12 h光照和12 h黑暗的清洁环境中，温度(22±1)℃，自由进食和饮水。在研究过程中对小鼠处理均按照国家颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》和山西大同大学医学研究伦理委员会的要求严格执行。

按照随机数字表法将小鼠分为正常饮食组(n=30)和高脂饮食组(n=30)。每组再分别分为假手术组和模型组两个亚组，每个亚组15只。正常饮食组以标准饲料配方饲养；高脂饮食组以高脂/高碳水化合物饮食饲养，高脂饮食主要包括20%蛋白、35%碳水化合物和45%脂肪(购于中国医学科学院实验动物研究所)。饲养周期为3个月，然后检测小鼠体质量。

1.2 实验试剂

2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-chlorinated three phenyl tetrazolium chloride,TTC)染料：美国SIGMA公司。兔源多克隆Sirt1、Wnt和AIF抗体：美国SANTA公司。

1.3 Lee指数

Lee指数用于评价小鼠肥胖程度的有效指数[9-10]。

其中体长指的是小鼠从鼻尖到肛门的长度。

1.4 大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型及分组

小鼠饲养3个月后，采用腹腔注射1%戊巴比妥钠0.06 g/kg麻醉小鼠，然后颈部剪毛，手术刀行1 cm左右的正中切口，再用止血钳钝性分离肌肉，充分暴露胸锁乳突肌。在显微镜下可以观察到左侧颈动脉鞘，然后分离出颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。然后用缝合线结扎颈总动脉近心端和颈外动脉远心端，用针头在颈外动脉远端动脉壁上扎一个小口，将准备好的线栓从颈外动脉小孔插入颈总动脉，通过颈内动脉最后到达大脑中动脉，用缝合线固定线栓，然后缝皮。

假手术组仅分离颈部血管，不进行大脑中动脉梗阻，除不插入栓线外，其他手术操作步骤同模型组。

1.5 神经行为学评分

造模后7 d，根据文献提到的方法[11]，对模型组小鼠进行神经行为学评分。观察性评价指标包括运动减少、拖地步态、姿势侧倾、共济失调、抽搐、震颤和呼吸窘迫等。操作性评分指标包括前肢屈曲、低反应性、身体旋转、肌肉强度降低和运动失调等。评估分值越高，神经损伤程度越严重。

1.6 TTC染色

神经行为学评分后，每亚组取5只小鼠迅速断头取脑，放入-20℃冰箱冷冻约15 min后，行冠状切片，厚度1.5 mm。将切好的脑片迅速放入准备好的1%TTC磷酸盐缓冲液中，在37℃水浴中避光孵育10 min。脑梗死区域不染色(灰白色)，而正常脑组织染为深红色。依据相关文献报道[12]方法计算造模后脑梗死体积。

1.7 Western blotting

神经行为学评分后，每亚组取5只小鼠迅速断头取脑，提取小鼠缺血大脑皮层蛋白，按10 ml/g比例加入全细胞裂解液Tris-Cl 50(pH 7.5)、乙二醇双四乙酸、乙二胺四乙酸、二巯基苏糖醇、Na4P2O7、冈田酸、高肽酶素、抑肽酶、胃酶抑素A、糜蛋白酶抑制素各5 mg/L，2%SDS。匀浆、超声破碎，待组织细胞全部溶解后。BCA法进行蛋白定量，加入Loading Buffer制备成电泳样品。取30 μg进行SDS-PAGE电泳，然后转至PVDF膜上。经5%牛奶孵育1 h后，并用磷酸盐缓冲液洗膜3次，每次10 min。用兔源Sirt1、Wnt和AIF(1∶2000)和鼠抗β-actin多克隆抗体(1∶2000)4℃孵育3 h，PBS-T洗3次，每次10 min。用PBS-T稀释山羊抗兔和山羊抗鼠的二抗(1∶25000)，室温孵育1 h。PBS-T洗3次，每次5 min。利用化学发光扫描系统检测相关蛋白表达并摄片，采用Quantity One图像分析软件对目标条带吸光度积值进行分析，以β-actin条带吸光度积值做为参照，两者比值为目标蛋白的表达水平。

1.8 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件进行分析，结果以(xˉ±s)表示。组间比较采用多因素方差分析或t检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 肥胖

与正常饮食组比较，高脂饮食组3个月后体质量明显增加(P＜0.01)，Lee指数增高(P＜0.05)。见表1。

表1 两组饲养3个月后体质量和Lee指数比较

2.2 神经行为学评分

造模后7 d，与正常饮食组比较，高脂饮食组神经行为学评分增加(P＜0.05)。见表2。

2.3 脑梗死体积

TTC结果显示，两组造模后脑梗死体积无显著性差异(P＞0.05)。见表2和图1。

2.4 Sirt1表达

无论是正常饮食还是高脂饮食，模型组Sirt1表达均低于假手术组(P＜0.05)。模型组中，高脂饮食小鼠Sirt1表达高于正常饮食小鼠(P＜0.05)。见表3、图2。

2.5 Wnt表达

无论是正常饮食还是高脂饮食，模型组Wnt表达均明显低于假手术组(P＜0.01)。模型组中，高脂饮食小鼠Wnt表达明显低于正常饮食小鼠(P＜0.01)。见表4、图3。

2.6 AIF核转位表达

高脂饮食小鼠中，模型组AIF核转位表达高于假手术组(P＜0.05)；在模型组中，与正常饮食小鼠比较，高脂饮食小鼠AIF核转位表达增加(P＜0.05)。见表5、图4。

图1 两组脑梗死体积比较(TTC染色)

表3 各组Sirt1表达比较

表4 各组Wnt表达比较

表5 各组AIF核转位表达比较

图2 各组Sirt1表达(Western blotting)

图3 各组Wnt表达(Western blotting)

图4 各组AIF核转位表达(Western blotting)

3 讨论

本研究结果显示，与正常饮食小鼠相比，高脂饮食小鼠在缺血损伤后恢复减慢，神经行为学评分增加。然而，正常饮食和高脂饮食小鼠缺血损伤后脑梗死体积无统计学差异。本研究还发现，高脂饮食饲养小鼠大脑皮层Sirt1表达增加。此外，高脂饮食饲养小鼠缺血损伤后Wnt表达几乎消失。最后，高脂饮食饲养小鼠缺血损伤后AIF转位细胞核明显升高，这是细胞凋亡的一个重要途径。这些结果表明，正常和高脂饮食小鼠MCAO后脑梗死体积无差异可能是由于Sirt1神经保护作用；而高脂饮食饲养小鼠在MCAO后恢复减慢可能与Wnt信号通路减弱及AIF核转位相关。

高饱和脂肪饮食与肥胖、2型糖尿病和代谢综合征相关，但高饱和脂肪饮食对这些并发症影响在人或动物模型中没有被广泛研究[13-14]。临床和病理学研究均表明，由于肥胖引起的2型糖尿病患者血糖升高与严重的脑梗死和脑出血相关[15-16]。最近研究还表明，糖尿病可调节新生血管生成[17]。Sirt1可调节血管生成、血管舒张及血液供应。叉头框蛋白1(Forked frame protein 1,FOXO1)去乙酰可使Sirt1抑制内皮细胞衰老，促进内皮细胞生长，血管发芽，以及血管形成[18]。也有研究报道，Sirt1对高脂肪饮食后代谢紊乱的肌肉和肝脏具有保护作用[19-20]。然而，我们的研究首次发现，高脂饮食喂养小鼠大脑Sirt1表达增高，可能与血管生成和大脑重塑有关，从而导致正常饮食小鼠和高脂饮食小鼠MCAO后脑梗死体积无显著差异。

经典Wnt信号通路是哺乳动物中枢神经系统发育、细胞增殖、分化和迁移至关重要的细胞外因素[21]。Wnt蛋白在胚胎发育、细胞分化和细胞生存中发挥作用[22]。最近研究表明，氧糖剥夺期间，Wnt1减少有助于细胞损伤、细胞凋亡和DNA降解[23]。Wnt可阻止神经元退行性变性，因而阻断Wnt可抑制神经保护作用，影响神经功能恢复[24]。本研究结果与以前的研究一致，缺血后Wnt介导脑神经保护作用减弱，而且高脂饮食使Wnt表达几乎消化，这可能是MCAO后神经功能恢复减慢的主要原因。在脑发育以及神经组织损伤中，细胞凋亡途径起着重要作用[25]。AIF是一种非caspase依赖性细胞死亡因子，死亡信号可使其激活，从线粒体释放并转移到细胞核[26]。脑缺血后神经元AIF核转位，导致细胞凋亡。在本研究中，我们发现，高脂饮食喂养小鼠MCAO后由于AIF核转位可能导致神经元凋亡。

总之，本研究证实肥胖可影响小鼠缺血损伤后恢复。Wnt表达减少可能导致高脂饮食饲养小鼠MCAO后神经功能恢复减慢。