水稻离体叶片纹枯病接种样品菌量检测方法研究

曲海艳，袁正杰，潘龙玉，何海燕，许赵蒙，瞿绍洪，*

(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321004；2.浙江省农业科学院 病毒学与生物技术研究所，浙江 杭州 310021)

水稻纹枯病是由立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)引起的水稻病害，是世界水稻三大病害之一[1-2]。水稻对纹枯病的抗性属于典型的数量遗传性状[3]，易受环境影响。目前，尚未发现高抗或免疫的水稻种质材料。此外，在水稻纹枯病的早期阶段，通过对病症的目测不容易观察到纹枯病菌的侵染。这些不利因素严重阻碍了水稻纹枯病的防治和抗病育种研究[2]。

目前，水稻抗纹枯病种质筛选和QTL抗性鉴定，主要通过对水稻纹枯病发病的严重程度和对不同水稻品种的抗感性差异进行视觉评估。在水稻分蘖末期接种纹枯菌的田间抗性鉴定方法[4]，具有鉴定结果比较稳定可靠的优点，但是工作量大，试验周期长，且易受季节限制。Jia等[5]针对苗期水稻纹枯病的接种，建立了用可乐瓶营造接种植株微环境的“微室”接种法。但总体而言，该方法在温室接种条件下还存在不精细、不稳定等问题，水稻的接种苗龄、接种操作步骤、病情评价体系等尚不统一，试验数据的可重复性有待提高。由Prasad等[6]建立的离体叶片接种方法，虽然取材方便、操作快速简便，但是依赖目测病斑面积，难以对病菌扩展和水稻发病程度进行准确测量。我们对离体叶片接种方法进行了改进：将目测调查评价接种样品纹枯病级的方式，改为通过病斑面积分换算来计算接种叶片的相对发病面积，从而对发病程度进行量化检测[7]。

基于病斑目测评估进行水稻纹枯病病级鉴定的各种方法，均易受到评估者主观差异的影响。在比较不同评估人员的研究结果时，这种个体差异显得尤为突出。Sayler等[8]利用定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)方法，对水稻离体叶片纹枯病接种材料，进行纹枯病菌量的检测，从而对病菌扩展和水稻发病程度进行定量分析。为了有效地运用接种水稻组织纹枯菌相对含量的qPCR检测方法，我们结合本实验室改进的水稻离体叶片纹枯病接种方法[7]，对我国水稻品种材料的纹枯病抗性差异进行了鉴定。通过精确控制接种条件，扫描离体叶片的病斑和统计分析相对病斑面积，准确验证了以上qPCR检测方法的结果。通过大田接种试验进一步证明，以上关于纹枯病菌DNA的qPCR方法，能够快速有效地检测不同水稻材料间的纹枯病抗性差异。这将为量化真菌的侵染程度、评价水稻品种的抗性水平、快速筛选水稻纹枯病抗性种质和进行纹枯病的早期预报，提供有效的检测手段。

1 材料与方法

1.1 材料

供试水稻品种为：纹枯病抗性材料YSBR1[9]，感病材料Lemont[9]、泰粳394[10]、台北309[11]和徐稻3号[12]。供试纹枯病菌系YN-7由扬州大学潘学彪教授惠赠。

1.2 水稻离体叶片纹枯病接种

1.2.1 水稻种植

将水稻种子封装于羊皮纸袋中，进行浸种发芽。发芽至第6天，将长势一致的稻芽点播于育秧田中。播种25 d后将生长状况良好的秧苗移栽至大田。在水稻分蘖后期(移栽后大约30 d)，选取叶色浓绿、生长健壮且无病虫害的分蘖，取其完全展开的倒一叶或倒二叶，进行水稻纹枯病离体接种。

1.2.2 纹枯菌培养

活化培养：将带有纹枯菌菌丝的琼脂块通过无菌手术刀切成0.4～0.5 cm2小块，接种到四环素浓度为0.005%的马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA)培养基的平板上。封口膜封口后，倒置于28 ℃培养箱中，活化培养2～3 d，至白色菌丝长满培养基表面时取出。

扩大培养：将来自活化培养的0.4～0.5 cm2菌块，接种到新的PDA培养基，相同条件下培养2～3 d，至白色菌丝长满培养基表面时取出，备用。

1.2.3 水稻离体叶片的纹枯病菌接种

取分蘖后期水稻叶片，剪取4 cm长的中间部分，使叶片背轴面向上，平铺在含有苯并咪唑(0.000 1 g·mL-1)的水琼脂培养基(0.005 g·mL-1)表面。在扩大培养的长满纹枯病菌的培养基相同半径处，用表面灭菌的打孔器，取带有菌丝的PDA琼脂块，直径约7 mm。将菌块放置于离体叶片的中间部位，带有菌丝的一面紧贴叶片背轴面。封口膜封口后，移至28 ℃培养箱中培养。不同水稻材料各取1块离体叶组织，放入含有水琼脂培养基的培养皿中，接种纹枯病菌。1个培养皿视作1个接种重复。另外取同一套水稻材料，接种无菌琼脂块，作为对照。

1.2.4 水稻离体叶片接种后病斑面积的测量

接种处理72 h后，用数字扫描仪对同一培养皿的不同水稻材料的离体叶片进行扫描。利用Photoshop软件，将扫描照片的病斑面积换算为像素，用公式计算相对病斑面积(relative lesion area，RLA)[13]。通过Tukey法，分别用纹枯病菌株YN-7对每个水稻品种接种2次，每次6个重复(6皿)；通过积分换算方法，计算相对病斑面积，进而确定不同品种的纹枯病抗性。然后对各水稻品种的平均相对病斑面积进行方差分析和多重比较，具体参见马晨燕等[7]。

1.3 水稻叶片纹枯病接种样品的菌量检测

1.3.1 接种纹枯病菌水稻叶片组织的取样和DNA提取

分别在接种24 h和48 h后，于无菌操作台中打开培养皿，从YN-7菌株和无菌对照处理取接种的离体水稻叶片。每块离体叶组织剪取以琼脂块为中心的菌丝扩展区域(叶片径向约3 cm长)，3～4块叶组织混合，迅速置于液氮冷冻，然后于-80 ℃保存备用。

DNA提取：取300 mg带菌丝的叶片组织，液氮研磨，加入400 μL提取缓冲液(0.3 mol·L-1NaCl，50 mmol·L-1Tris-HCl pH 7.5，20 mmol·L-1EDTA，2%肌氨酰，0.5%十二烷基硫酸钠，5 mol·L-1尿素)，再加入400 μL苯酚/氯仿混合液(体积比1∶1，pH 8.0)，涡旋振荡10 min，14 000 r·min-1离心5 min。取上清转移到新的离心管，加入2 μL RNase(10 mg·mL-1)，涡旋振荡几秒钟，37 ℃下保温1 h。加入0.7倍体积的异丙醇；14 000 r·min-1离心5 min；DNA沉淀用70%乙醇洗涤，干燥。提取的DNA样品用100 μL Tris (10 mmol·L-1)-EDTA (1 mmol·L-1)溶解，再用1%琼脂糖凝胶电泳检查DNA质量，用NanoDrop紫外-可见分光光度计(NanoDrop 8000 UV-Vis Spectrophotometer)检测DNA浓度和纯度。

1.3.2 纹枯病qPCR分析的引物与标准曲线

参照Sayler等[8]检测水稻离体叶片接种样品中纹枯病菌含量的方法，纹枯菌基因组保守序列的特异引物(Rs-F/Rs-R)以及水稻基因组特异引物(RUBQ-F/RUBQ-R)见表1。Rs-F和Rs-R来自纹枯菌AG-1 IA转录间隔区SPM2序列(GenBank accession number KX674525.1)，RUBQ-F和RUBQ-R来自水稻泛素基因序列(LOC_Os06g46770; GenBank accession number AP014962.1)。以接种叶片组织的提取DNA为模板，分别用Rs-F/Rs-R和RUBQ-F/RUBQ-R引物对进行PCR，扩增产物经过TA克隆和测序验证。

在ABI PRISM7900 qPCR检测系统上进行qPCR反应。采用SYBR®qPCR Mix试剂盒(TOYOBO公司)。每个qPCR反应设置3次重复。反应体系(25 μL)为：12.5 μL Mix，1 pmol·L-1引物，100 ng DNA。反应程序为：95 ℃，15 min；95 ℃，15 s；52 ℃，30 s；72 ℃，15 s；40个反应循环；95 ℃，1 min；55 ℃，30 s。

从单纯培养纹枯病菌的PDA培养基采取菌丝，提取纹枯病菌DNA。以10倍梯度(100 ng、10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg)，稀释纹枯病菌DNA。以梯度稀释的样本为模板，用纹枯菌特异引物Rs-F/Rs-R，进行qPCR实验，每个样本设置3个重复，用于制作标准曲线。

1.3.3 接种水稻叶片纹枯病菌DNA的定量PCR分析

以接种叶片组织的提取DNA为模板，利用纹枯菌及水稻特异引物(表1)，分别进行定量qPCR分析。根据纹枯菌SPM2序列和水稻泛素基因的qPCR数据，分别估算纹枯病菌DNA含量和水稻DNA含量，进而计算纹枯病菌DNA含量和水稻DNA含量的比值(ngR.solaniDNA/1 ng rice DNA)。设置3次重复，进行数据的统计分析。

1.4 水稻大田成株期纹枯病接种鉴定

2017年5—10月在浙江省农业科学院试验田进行水稻品种YSBR1、Lemont和泰粳394的大田成株期纹枯病接种试验。水稻种子于5月12—18日发芽，5月19日播种。秧苗于6月20日移栽大田，每个小区栽插2行，每行12个单株。每个品种种植2次，随机区组设计。在水稻分蘖后期(2017年8月23日)，取每个小区第 1行(即接种行)的9～10个植株，每株取3个分蘖，采用嵌入法[14-15]，接种纹枯病菌系YN-7。在抽穗后30 d(10月5—12日)，采用Rush等[16]的0～9级病情评价体系，取接种行中间的7～8个接种植株，计算分蘖的纹枯病平均病级作为单个植株病级。对各水稻品种的纹枯病病级进行方差分析和多重比较[7]。

表1纹枯病菌与水稻泛素基因的特异性引物

Table1Primers specific forR.solaniAG-1 IA and the rice ubiquitin gene

引物Primer基因号Gene ID引物序列Primer sequence(5'-3')参考文献ReferenceRsKX674525.1F: GCCTTTTCTACCTTAATTTGGCAGR: GTGTGTAAATTAAGTAGACAGCAAATG[8]RUBQOs06g46770F: GTGGCCAGTAAGTCCTCAGCR: GAAACGGGACACGACCAAGG[8]

2 结果与分析

2.1 水稻纹枯菌PCR产物测序验证和qPCR标准曲线制作

本研究的接种试验与Sayler等[8]试验的纹枯病菌系和水稻品种均不一样，所以PCR引物和扩增序列需要进一步验证。根据纹枯菌AG-1 IA转录间隔区SPM2序列(GenBank登录号：KX674525.1)，在Rs-F和Rs-R引物的扩增序列的外围，分别延长50～100 bp，再次设计验证引物。以水稻纹枯病菌系YN-7的提取DNA为模板，进行PCR扩增。扩增产物经过TA克隆和测序、比对，结果表明，YN-7扩增序列与以上SPM2序列完全一致，因此Rs-F和Rs-R引物适用于本研究的qPCR实验。用梯度稀释的YN-7菌系的DNA为模板和Rs-F/Rs-R引物，进行qPCR，制作标准曲线(图1)。Ct值与稀释YN-7菌系DNA的log值呈负线性关系(R2=0.998 6)。

Y，Ct值；X，纹枯病菌DNA含量的对数值。Y，Cycle threshold (Ct) value; X，log R. solani DNA content.图1 qPCR检测中纹枯病菌DNA含量与Ct值关系的标准曲线Fig.1 The standard curve showing the linear relationship between R. solani DNA content and Ct value in qPCR

2.2 接种叶片纹枯菌DNA含量的qPCR检测

从YSBR1、Lemont、泰粳394、台北309和徐稻3号的分蘖期水稻植株，接种处理后提取水稻叶片组织的DNA。采用图1的标准曲线，通过qPCR方法检测不同水稻材料叶片组织中纹枯菌DNA的相对含量。如图2所示，将相同水稻品种48和72 h接种时间点的接种样品进行比较，72 h时纹枯病菌DNA的相对含量，均高于相应48 h样品的相对含量。在48和72 h接种时间点，YSBR1接种样品中纹枯病菌DNA的相对含量，均低于相应时间点的其他水稻品种接种样品的相对含量。说明YSBR1的纹枯病抗性最强。依此类推，徐稻3号、台北309和泰粳394的纹枯病菌相对含量依次增加，说明其纹枯病抗性依次减弱。Lemont接种样品的纹枯病菌相对含量最高，因而对纹枯病菌最为敏感。

ng R.solani DNA/100 ng total DNA：接种组织每100 ng总DNA中纹枯菌DNA的含量。ng R.solani DNA/100 ng total DNA: R. solani DNA content in every 100 ng total DNA of inoculated tissue.图2 接种组织总DNA中纹枯菌DNA的qPCR分析Fig.2 qPCR analysis of R. solani DNA in the total DNA of inoculated tissues

纹枯病菌侵染的叶片样品的水稻生物量，可以通过水稻泛素基因qPCR检测指标进行估算[8]。用梯度稀释的未接种水稻的DNA模板和泛素基因引物进行qPCR，制作标准曲线(图3)。结果显示，Ct值与水稻DNA含量log值呈负线性关系(R2=0.997 1)。

根据纹枯菌SPM2序列和水稻泛素基因的qPCR数据，估算不同水稻品种的接种组织中纹枯菌与水稻DNA的比值(图4)，进而估算接种样品的纹枯菌相对含量。与图2的结果一致，相同水稻品种的72 h样品中纹枯病菌含量，均高于其48 h样品中的相应含量；在48和72 h接种时间点，各水稻品种的接种样品的纹枯病菌DNA含量，从低到高的顺序均为：YSBR1、徐稻3号、台北309、泰粳394和Lemont(图4)。

2.3 水稻离体叶片纹枯病接种样品相对病斑面积的统计分析

从YSBR1、Lemont、徐稻3号、台北309和泰粳394的分蘖期水稻植株，取离体叶片，进行了2次纹枯病菌接种。在72 h时，各品种的叶片出现面积大小不等的纹枯病病斑。YSBR1叶片的大部分保持青绿色，病斑面积较小；Lemont叶色发黄，病斑蔓延叶片2/3以上；泰粳394、台北309和徐稻3号离体叶片上面分别有不同程度的病斑蔓延面积。

Y，Ct值；X，水稻DNA含量的对数值。Y，Cycle threshold (Ct) value; X，log rice DNA content.图3 qPCR检测中水稻DNA含量与Ct值关系的标准曲线Fig.3 The standard curve showing the linear relationship between rice DNA content and Ct value in qPCR

ng R. solani DNA/1 ng rice DNA：接种组织中纹枯菌和水稻DNA含量的比值。ng R. solani DNA/1 ng rice DNA: ratio of R. solani DNA and rice DNA in the inoculated tissue.图4 接种组织纹枯菌和水稻DNA相对含量的qPCR分析Fig.4 qPCR quantification of the relative content of R. solani and rice DNA in inoculated tissues

利用数字扫描仪，对72 h接种时间点的离体叶片进行病斑扫描。用Photoshop软件，将扫描照片上的病斑面积进行像素换算(图5)，计算相对病斑面积(RLA)，然后对 YSBR1、Lemont 和泰粳394的RLA数据进行方差分析(表2)。在2次重复离体叶片接种试验中，YSBR1、泰粳394与Lemont之间的RLA数据均表现有显著差异(P<0.05)；台北309和徐稻3号与以上3个水稻品种之间的RLA数据也均表现有显著差异(P<0.05)，但是台北309与徐稻3号两者之间的RLA数据没有显著差异。因此，离体叶片接种样品相对病斑面积的统计分析结果，进一步验证了各水稻品种对纹枯病菌抗感程度的差异。

2.4 供试水稻品种田间成株期接种验证

对YSBR1、Lemont和泰粳394进行了大田成株期纹枯病接种试验。根据Rush等[16]的0～9 级病情评价体系，YSBR1、Lemont和泰粳394的平均病级分别为4.47、9.00和6.90，相互呈显著差异。上述结果进一步验证了抗病品种YSBR1分别与感病品种泰粳394和Lemont之间的纹枯病病级差异，以及感病品种泰粳394和Lemont之间的病级差异。

纹枯病菌株YN-7侵染水稻离体叶片72 h后病斑扫描(A)与Photoshop软件处理结果(B)。R.solani strains YN-7 was inoculated to rice cultivars. Scanned lesions (A) and Photoshop software processing results (B).图5 水稻离体叶片接种纹枯病菌的病斑扫描Fig.5 Digital scanning of the sheath blight lesions on detached rice leaves infected with R.solani

表2纹枯菌侵染水稻离体叶片相对病斑面积的统计分析

Table2Statistical analysis of the relative lesion area of detached rice leaves infected withR.solani

试验Experiment水稻品种Cultivar各接种重复相对病斑面积Relative lesion area of each repeat123456平均Average第1次YSBR10.01 0.04 0.03 0.00 0.04 0.04 0.03 dThe first experiment徐稻3号Xudao No.30.13 0.12 0.17 0.13 0.16 0.13 0.14 c台北309 Taibei 3090.15 0.14 0.14 0.19 0.22 0.15 0.16 c泰粳394 Taijing 3940.38 0.33 0.35 0.35 0.33 0.32 0.34 bLemont0.57 0.58 0.57 0.59 0.49 0.67 0.58 a第2次YSBR10.05 0.02 0.03 0.01 0.02 0.01 0.02 dThe second experiment徐稻3号Xudao No.30.17 0.14 0.16 0.15 0.20 0.14 0.16 c台北309 Taibei 3090.15 0.23 0.13 0.13 0.24 0.12 0.17 c泰粳394 Taijing 3940.38 0.49 0.34 0.40 0.41 0.38 0.40 bLemont0.71 0.60 0.61 0.54 0.55 0.57 0.60 a

标注不同字母的平均病斑面积之间存在显著差异(P<0.05)。

The average lesion areas labelled with different letters showed significant difference (P<0.05).

3 讨论

本研究根据马晨燕等[7]对水稻离体叶片纹枯病接种方法的改进，对接种条件进行更精确的控制，进而对离体叶片的纹枯菌DNA进行qPCR检测。与Sayler等[8]对离体叶片纹枯病病斑长度的测量方法相比较，本研究采用的病斑扫描和计算相对病斑面积的方法，在关于纹枯病菌株YN-7的2次重复接种试验中，都取得了显著差异的结果。大田水稻纹枯病接种试验进一步验证了各品种的纹枯病抗性差异的结果。因此，改进的离体叶片接种方法与纹枯菌DNA的qPCR检测可以结合起来，具有快速简便和易于重复的优点，适用于大规模水稻种质材料抗纹枯病性状的筛选。此外，在水稻发病早期，通过目测难以观察到纹枯菌侵染和病症[3]。因此，水稻组织中纹枯菌DNA的qPCR检测方法可以用于水稻生产中纹枯病的早期预报和防治。

表3水稻大田成株期纹枯病接种的病级

Table3The sheath blight scores of rice adult plants inoculated withR.solanion field

品种Cultivar大田水稻植株的纹枯病病级Sheath blight score of rice plants on field植株数Plant number平均病级AverageYSBR15.00 4.50 4.00 4.00 4.00 5.00 4.50 5.00 164.47 c4.00 3.00 4.50 4.00 5.00 4.00 7.00 4.00 泰粳394 Taijing 3947.00 7.00 7.00 7.00 5.00 7.00 7.00 7.00 156.90 b7.00 7.50 7.00 7.00 7.00 6.00 8.00Lemont9.00 9.00 9.00 9.00 9.00 9.00 9.00 9.00 169.00 a9.00 9.00 9.00 9.00 9.00 9.00 9.00 9.00

标注不同字母的平均病级之间存在显著差异(P<0.05)。

The average disease scores labelled with different letters showed significant difference (P<0.05).

根据水稻离体叶片纹枯病菌DNA的qPCR分析结果，相同接种材料72 h时间点的纹枯病菌含量明显高于48 h时间点的相应含量。在48和72 h接种时间点，均能检测到各水稻品种接种样品中纹枯病菌含量的差别和变化趋势。因此，不同时间点纹枯病菌含量的变化，验证了纹枯病菌对水稻离体叶片组织的侵染。这种在精确控制的环境条件下检测纹枯菌含量的方法，还可以用于水稻和纹枯病菌分子互作的研究。

本研究中对水稻离体叶片和大田水稻成株期叶片进行纹枯病接种，取得了一致的试验结果。对离体接种样品纹枯菌的含量进行qPCR检测，具有简便、精确等优势，适用于水稻与纹枯病菌互作研究。在水稻抗纹枯病种质筛选过程中，建议先用离体叶片接种方法进行初选，再结合大田水稻纹枯病接种试验，对筛选材料进行验证，从而满足大规模水稻种质资源抗性筛选的需求。