不同唑类药物体外诱导热带念珠菌耐药特征及其耐药机制研究

范欣 黄晶晶 侯欣 肖盟 张丽 徐英春

(1.首都医科大学附属北京朝阳医院感染和临床微生物科，北京100020；2. 中国医学科学院北京协和医院检验科，北京100730；3. 侵袭性真菌病机制研究与精准诊断北京市重点实验室，北京100730)

热带念珠菌是临床重要的常见病原真菌之一，可引起多种临床相关感染，尤其严重和值得关注的是热带念珠菌易感染肿瘤、中性粒细胞缺乏、骨髓移植的患者，引起念珠菌血症或全身播散性感染[1]。唑类药物是用来治疗热带念珠菌感染最常用的抗真菌药物，但是近年来的监测数据显示，我国热带念珠菌对唑类耐药率呈现急剧上升，非敏感率已达到约40%[2]。如此严峻的耐药形势，亟待开展热带念珠菌唑类耐药相关的研究，为今后更有针对性地、更有效地遏制整体耐药现状的发生提供依据。本研究将用3种不同的唑类药物对同一株临床分离唑类敏感的热带念珠菌进行体外耐药性诱导，比较不同药物诱导的特点以及药物诱导菌耐药机制的不同。

1 材料与方法

1.1 菌株选取及体外诱导耐药

选取1株临床分离的氟康唑敏感株PU001作为实验株，模拟氟康唑、伏立康唑、泊沙康唑临床治疗时药物血清浓度(氟康唑16μg/mL，伏立康唑2μg/mL，泊沙康唑1μg/mL)，在含药培养基中进行体外传代培养，诱导其对唑类药物耐药[3]。具体诱导方式如下：从沙堡弱培养基上取实验株的单克隆菌于10mL RPMI-1640肉汤，180 r/min 35℃摇菌过夜，菌悬液浓度达到108个/mL时，取10μL(约106个菌)分别接种于10 mL含不同唑类药物的RPMI-1640肉汤中；同时取1 mL菌悬液留菌，-80℃冻存。转种后的菌液继续180 r/min 35℃摇菌，至菌悬液菌悬液浓度达到108 个/mL，重复上述操作，50%甘油留菌，并转种；转种至第50代后，留菌并停止传种。

1.2 抗真菌药物敏感性检测及分子分型

复苏诱导留存的所有传代菌，采用商品化显色微量肉汤稀释药敏板Sensititre YeastOne YO10复核菌株对9种常用抗真菌药物(氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净、5-氟胞嘧啶、两性霉素B)的MIC值，并绘制3种不同药物诱导传代菌的唑类MIC值变化曲线。

另外，采用ctm1-ctm3-ctm24三位点微卫星分型体系对每一代体外诱导菌株进行分子分型[4]，以确定体外传代诱导的准确性及可靠性。

1.3 体外诱导唑类耐药菌株耐药机制检测

ERG11基因扩增测序及比对

玻璃珠震荡法提取原代菌与3种唑类药物第50代诱导菌的DNA。采用特异性引物对唑类药物靶位点编码基因ERG11进行扩增及序列测定。本研究所使用的扩增测序引物如下：ERG11-F：ATGGCTATTGTTGATACTGCC；ERG11-R：CTAAACCATACAAGTATCTC。比对原代菌与第50代诱导菌ERG11基因的核酸序列，并预测蛋白质氨基酸替换。

耐药相关基因表达量分析

提取原代菌与3种唑类药物第50代诱导菌的总RNA，采用SYBR Green法对唑类耐药相关的靶位点基因ERG11、泵蛋白基因MDR1、CDR1以及线粒体细胞色素b基因CYTb进行荧光定量PCR检测。以Actin作为内参基因，原代菌表达量为对照，采用ΔΔCt法分析诱导菌耐药相关基因表达量的变化。

2 结果

2.1 3种唑类药物体外诱导菌MIC值变化

分子分型结果显示，原代菌与传代菌均属于同一微卫星型别，3个微卫星位点的读长分别为： 188bp/188bp(ctm-1)； 241bp/255 bp(ctm-3)； 212 bp /228 bp(ctm-24)。在模拟治疗剂量药物血清浓度下，经50次传代诱导，氟康唑(16 μg/mL)与伏立康唑(2 μg/mL)诱导出了耐药菌株，而泊沙康唑(1 μg/mL)经50次传代诱导后菌株仍然对唑类药物保持敏感，并未诱导出耐药菌(见图1-3)。

在16 μg/mL氟康唑的作用下，菌株对4种唑类药物的MIC值呈现逐渐升高的趋势。从第8代开始，诱导菌对氟康唑、伏立康唑药物的MIC值上升至较高水平，并趋于稳定。氟康唑MIC值由1 μg/mL上升至32～64μg/mL之间；对伏立康唑MIC值由0.06 μg/mL上升至2 μg/mL，并在2 μg/mL上下一个梯度波动。但是，对伊曲康唑及泊沙康唑MIC值上升并不明显，仅1～2个稀释梯度(见图1)。

伏立康唑诱导菌对4种唑类药物的MIC值都呈现明显的跳跃式升高，尤其是氟康唑、伏立康唑。第15代菌MIC值急剧增高，与前一代菌相比，氟康唑MIC值由2 μg/mL升高至32 μg/mL；伏立康唑由0.06 μg/mL直接上升至1 μg/mL；伊曲康唑、泊沙康唑的MIC值都由0.06 μg/mL上升至0.25 μg/mL(见图2)。

图1 伏立康唑诱导菌4种唑类药物MIC值变化Fig.1 Variations of four azoles’ MICs for isolates induced by voricaonzole.

图2 伏立康唑诱导菌4种唑类药物MIC值变化Fig.2 Variations of four azoles’ MICs for isolates induced by voricaonzole.

图3 泊沙康唑诱导菌4种唑类药物MIC值变化Fig.3 Variations of four azoles’ MICs for isolates induced by posaconazole.

相比氟康唑和伏立康唑，模拟治疗剂量的泊沙康唑(1 μg/mL)经50次传代并没有使得菌株对唑类药物MIC值的升高。与原代相比，菌株对唑类药物的MIC值都在±1个稀释梯度波动(见图3)。

2.2 体外诱导耐药株耐药机制研究

ERG11突变检测 通过对3种不同唑类药物第50代传代菌的ERG11基因测序，并与原代PU001的ERG11基因比对发现，除伏立康唑诱导菌株出现了G/G1390A/G杂合突变外，氟康唑诱导株与泊沙康唑诱导株的ERG11基因均没有出现碱基突变。蛋白质翻译预测G/G1390A/G突变会导致464位氨基酸由甘氨酸替换为丝氨酸(G464S)。

耐药相关基因表达量分析 以原代菌PU001基因表达量为对照组，CDR1在伏立康唑和氟康唑诱导的耐药菌中都呈现过表达状态(相对表达量在2.0以上)，其中伏立康唑诱导菌CDR1基因表达水平升高最为明显，相对表达量为3.98。同时，ERG11表达量在氟康唑诱导菌中也显著升高，相对表达量为2.49。MDR1及CYTb基因的表达量并未检测到显著差异。

3 讨论

由于真菌治疗药物种类较少，唑类药物耐药及交叉耐药大大限制了治疗的选择，严重影响患者的预后，并且增加患者的经济负担[5-7]。在过去很长一段时间，热带念珠菌对唑类都有非常高的敏感性，敏感率能够达到95%～98%。但近十年的国内外的监测数据都显示，热带念珠菌对唑类药物的耐药率明显升高，并且明显高于白念珠菌[8]。尤其是在我国近年的监测数据已经看到，我国侵袭性感染热带念珠菌的唑类药物非敏感率已经上升到约40%，耐药现状十分严峻[2]。既往已有研究发现热带念珠菌在体内或体外唑类药物暴露后会出现敏感性下降[1，9]，但不同唑类药物在药代/药效动力学、毒性、治疗剂量等方面均存在差别，不同唑类药物诱导耐药差异的研究较少。

本研究3种不同的唑类药物体外耐药性诱导的结果发现，体外氟康唑、伏立康唑暴露的情况下，菌株很快会出现耐药性；而泊沙康唑经50代诱导，菌株仍然没有出现耐药性。与此同时，也观察到在氟康唑、伏立康唑作用下，菌株耐药性出现的方式呈现不同特征。与氟康唑诱导MIC值逐渐上升的特性不同，伏立康唑诱导菌在第15代出现了明显的跳跃式升高，与前一代菌相比，氟康唑、伏立康唑的MIC值都迅速升高了4个稀释度；伊曲康唑、泊沙康唑的MIC值也都上升了2个稀释梯度。另外，与氟康唑诱导菌相比，传代后期伏立康唑诱导菌对氟康唑及伏立康唑的MIC值更高，伏立康唑诱导菌对氟康唑的MIC值后期升至128 μg/mL，高于氟康唑诱导菌1个梯度；伏立康唑的MIC值也在2～4 μg/mL波动，高于氟康唑诱导菌0～1个梯度。相比，两种药物诱导菌株对伊曲康唑与泊沙康唑的MIC值最后都稳定在0.5 μg/mL，没有差别。

热带念珠菌对唑类耐药的分子机制与其他念珠菌类似，已有的研究显示念珠菌对唑类耐药涉及的机制包括外排泵基因表达增高、编码药物靶酶基因的突变或过度表达等因素[10-12]。3种唑类药物第50代诱导菌的耐药机制研究结果显示，伏立康唑诱导菌ERG11基因1390位出现了G/G→G/A碱基杂合突变。该位点突变导致的G464S氨基酸替换，之前研究已经明确其有氟康唑耐药密切相关[13-14]，因此，该位点突变极有可能是造成伏立康唑诱导菌唑类药物MIC值跳跃性升高的原因。Barchiesi等[9]在实验室体外诱导标准菌株ATCC 750的耐药菌检测到两个主要外排转运蛋白基因，主要促进基因(major facilitator gene)MDR1及ABC转运蛋白基因(ATP-binding cassette transporter gene)CDR1的表达上调。但是，本研究的体外诱导耐药菌基因表达量分析结果显示，仅伏立康唑诱导耐药菌CDR1基因的相对表达量高于原代菌3倍以上，MDR1基因及氟康唑诱导耐药菌CDR1、MDR1基因的相对表达量都无显著改变。由于本研究体外诱导菌仅是1株临床分离株，因此结果的不一致很可能是由于菌株之间的异质性导致。

综合以上研究结果可以发现热带念珠菌在体外氟康唑、伏立康唑暴露情况下会很快出现耐药性，但出现的耐药特征以及机制有所差别。