新生隐球菌漆酶的原核表达

邓东灵 孔庆涛 张媛媛 袁红珊 刘慧 桑红

(南方医科大学金陵医院(南京军区南京总医院)皮肤科，210002 南京)

0 引言

新生隐球菌属担子菌门银耳纲银耳目银耳科隐球菌属，为酵母样真菌，是一种条件致病菌，好发于AIDS等免疫低下患者，主要引起隐球菌脑膜炎等深部真菌感染。随着现在免疫抑制剂及皮质类固醇的广泛使用、器官移植的开展、抗生素的滥用，新生隐球菌病在全球的发病率逐年增高。隐球菌属种类繁多，其中对人类致病的最主要为新生隐球菌(C.neoformans)和格特隐球菌(C.gattii)，新生隐球菌含新生变种(C.neoformansvar.neoformans)和格鲁比变种(C.neoformansvar. grubii)[1]，其致病因子主要与产生荚膜、合成黑素、分泌磷脂酶、产生甘露醇及适宜宿主体温的生长能力有关[2]。Kwonchung等[3]在1982年通过UV照射新生隐球菌发现其可产生白化突变株，并验证了黑素与新生隐球菌的毒力密切相关。研究发现黑素具有多种功能，如防御紫外线照射、电离辐射等环境应激[4]，清除自由基使细胞抗氧化[5]以及通过阻碍细胞因子的合成来影响宿主的免疫反应[6]。黑素分为DHN黑素及DOPA黑素，新生隐球菌主要合成DOPA黑素，即以儿茶酚胺为外源性底物，由多酚氧化酶催化胺类化合物先形成醌类中间产物，随后自动异构形成黑素[7]。1994年， Williamson[8]提纯新生隐球菌多酚氧化酶后发现其本质为漆酶，是一分子量大小为75kDa的糖化蛋白，脱糖基化后分子量大小为66kDa，含Ⅰ型及Ⅲ型铜。新生隐球菌漆酶主要由LAC1及LAC2基因编码，在黑素合成过程中，Lac1占主要作用。鉴于漆酶在新生隐球菌毒力中的重要作用，本研究拟构建新生隐球菌漆酶的原核表达载体，以得到含His-tag的重组lac蛋白，为进一步研究新生隐球菌漆酶的晶体结构及活性研究奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

培养基 LB培养基：酵母提取物 5g/L，胰蛋白胨 10g/L，氯化钠 10g/L。

主要试剂和仪器 原核表达载体pET-28a、E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)为本室保存；NdeⅠ、XhoⅠ限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、T4连接酶购买自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购买自omega公司；蛋白质水解酶Trypsin、三氟乙酸(TFA)和乙腈为色谱纯产品；测序由上海捷瑞生物工程有限公司完成。其余化学试剂均为国产分析纯产品。MALDI-TOF质谱仪为BRUKER公司产品(型号：UltrafleXtreme)，由南京大学配位化学国家重点实验室提供。

1.2 方法

目的基因的扩增 根据新生隐球菌漆酶基因cDNA序列(GenBank Accession No.AF140156)由上海捷瑞生物工程有限公司进行LAC1基因片段的全合成，前端添加His-tag，并设计扩增引物，上游引物为：5’-GATCACATATGCAGTACAAACTGATCCTGAACG-3’；下游引物为：5’-GATCACTCGAGTTATGCTTCGCGTGCGCCG-3’，其中上游引物含Nde I酶切位点，下游引物含XhoI酶切位点。以合成的目的基因片段为模板，PCR扩增，反应体系：H2O 36.4μL、2X Buffer 50 μL、dNTP 8μL(each 2.5 mmol/L)、NdeI-lac-F 0.8μL、lac-hrv3c-XhoI-R 0.8μL、DNA Polymerase 2μL、模板 2μL；反应条件如下：95℃预变性3 min、95℃变性15 s、56℃退火15 s、72℃延伸1 min，共29个循环，72℃再延伸10 min。琼脂糖(10g/L)DNA胶检测PCR产物，并用DNA胶回收试剂盒回收目的基因片段。

重组质粒pET-28a-lac的构建及鉴定 用NdeⅠ、XhoⅠ同时双酶切回收的目的基因片段及载体pET-28a(+)，DNA胶回收酶切好的PCR产物及载体，后用T4 DNA 连接酶于16℃过夜连接，构建重组质粒pET-28a-lac，转化至E.coliDH5α感受态细胞中，挑取单克隆活化菌液并提取质粒，进行PCR鉴定，将PCR阳性克隆的送上海捷瑞生物工程有限公司测序。

重组质粒pET-28a-lac的表达与蛋白质鉴定 将测序正确的重组质粒pET-28a-lac转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆菌落接种于LB液体培养基中(含30 μg/mL卡那霉素)，37℃，250 r/min振荡培养至吸光度A600nm=0.6时，加入终浓度为0.1 mmol/L IPTG，分别置于30℃、37℃诱导4 h或16℃诱导16 h，收集菌液，超声破菌后通过高速离心分离上清和沉淀，对不同组分进行SDS-PAGE电泳分析。回收对应分子量附近的条带进行Trypsin酶水解，通过MALDI-TOF质谱检测得到质谱信息，通过mascot上对质谱结果进行搜库鉴定，确定其是否为新生隐球菌漆酶Laccase 1。

重组质粒pET-28a-lac的包涵体处理与鉴定 菌液超声离心后弃上清取沉淀，水洗一次后加入2 mol/L尿素溶液，重溶后超声10 min，15000 r/min离心15 min，重复此过程至包涵体蛋白出现瓷白色，取少量包涵体进行SDS-PAGE电泳分析后再次行MALDI-TOF质谱鉴定其是否为目的蛋白。

2 结果

2.1 新生隐球菌漆酶基因LAC1序列的扩增

以含His-tag的新生隐球菌漆酶基因LAC1为模板，扩增序列，获得与预期片段大小(约2000bp)一致的PCR产物(见图1)。

2.2 重组质粒的构建及鉴定

用NdeⅠ、XhoⅠ同时双酶切目的基因片段及pET-28a(+)载体，DNA凝胶电泳(见图2)可见pET-28a(+)空载体质粒酶切条带及约2000bp的LAC1条带。连接酶切后的目的基因片段及pET-28a(+)载体，将其转化至E.coliDH5α感受态细胞中。挑取多个单克隆热裂解后作为PCR模版，使用LAC1扩增引物进行PCR鉴定。PCR鉴定结果：LAC1扩增引物进行PCR，获得了对应的(约2000 bp)LAC1条带(见图3)，取阳性菌株提取质粒进行测序鉴定。结果表明含His-tag的新生隐球菌漆酶基因LAC1的编码序列成功插入到pET-28a(+)载体中，DNA测序结果表明目的片段与已知序列完全一致，且无突变发生。

2.3 重组质粒pET-28a-lac的表达与鉴定

将测序正确的重组质粒转化E.coliBL21感受态细胞，至吸光度A600nm=0.6时加入终浓度为0.1 mmol/L IPTG诱导表达，分别置于30℃、37℃诱导4 h 或16℃诱导16 h，收集菌液，超声离心后菌体各组分经SDS-PAGE(见图4)和质谱分析鉴定(见图5)，结果显示，目的蛋白以包涵体的形式在沉淀中大量表达，37℃有利于包涵体蛋白的表达。

2.4 重组质粒pET-28a-lac的包涵体处理与鉴定

菌液超声离心后弃上清取沉淀，水洗一次后加入2 mol/L 尿素溶液，重溶后超声10 min，15000 r/min离心15 min，重复此过程至包涵体蛋白出现瓷白色，取少量包涵体进行SDS-PAGE电泳，结果显示在对应分子量处有目的蛋白表达，回收此条带行MALDI-TOF质谱检测(见图6)，通过在mascot上对质谱结果进行搜库鉴定后确定包涵体中为新生隐球菌漆酶蛋白。

3 讨论

漆酶普遍存在于真菌中，也存在于某些细菌和植物中，其主要产生者仍为真菌。漆酶在不同的生物体中充当着不同的角色，比如参与木质化与去木质化、真菌形态变化、去毒、植物感染以及氧化等过程[9]。植物真菌漆酶主要作用于木材中的木质素和纤维素，对于植物真菌漆酶的研究也主要集中在工业及环境领域。新生隐球菌漆酶则主要通过参与黑素合成从而产生毒力，黑素是一种广泛存在于自然界中的天然色素，一般以黑色、棕色为主，具有带负电荷、不溶于水及有机溶剂等特性。既往的研究表明，黑素是多种人类致病真菌的毒力因子，具有增强真菌抗氧化、抗溶菌酶、吸收紫外线、抵抗宿主免疫攻击和耐受抗真菌药物等作用[10]。根据合成途径不同，黑素一般分为DHN黑素及DOPA黑素，烟曲霉、黑曲霉、卡氏枝孢瓶霉等大多数半知菌及子囊菌均是以聚酮途径合成黑素，即通过氧化1，8-二羟基萘(DHN)从而合成黑素。不同于上述途径，新生隐球菌则是合成多巴(DOPA)黑素，即以儿茶酚胺为外源性底物，由多酚氧化酶催化胺类化合物先形成醌类中间产物，随后自动异构形成黑素[7]。多酚氧化酶属于蓝铜氧化酶一族(Blue multi-copper oxidases family)，根据光学及磁学特征的不同，可将蓝铜氧化酶的4个铜离子分为3类，即Type Ⅰ(蓝型铜)、 Type Ⅱ(通常型铜)、 Type Ⅲ(偶联的双核型铜)[11]。Ⅰ型铜在600nm处有强吸收峰，蓝铜氧化酶的蓝色也是由此产生的，Ⅱ型铜在可视区域内的吸收峰则相对较弱，Ⅲ型铜则是在330nm处有宽吸收带。1994年，Williamson[8]通过提纯新生隐球菌多酚氧化酶后将其定义为漆酶，分子量大小为75kDa，脱糖基化后为66kDa，且含Ⅰ型及Ⅲ型铜。新生隐球菌漆酶主要由LAC1及LAC2基因编码，Lac1位于细胞壁，而Lac2位于细胞质。Missall[12]的研究发现，在分别敲除LAC1及LAC2基因的培养基上均无黑素生成，结果说明两者均可促进黑素生成以及抗巨噬细胞吞噬作用。进行基因比对后发现，两者的基因结构相似，但在编码区相差甚远，这就导致了表达及转录上的显著差异，胞壁的位置更易于合成黑素以及促进儿茶酚胺和金属离子通过荚膜发挥免疫调节作用。因此，在黑素合成的过程中，Lac1起主要作用。

图1LAC1基因片段的PCR扩增 (M：DNA marker；1：LAC1基因片段)图2片段及载体的双酶切(M：DNA marker；1：pET-28a(+)载体质粒；2：LAC1基因片段)图3重组质粒的PCR鉴定(-：负对照；+：正对照；M：DNA marker；1-3：单克隆菌落)图4不同温度诱导表达的SDS-PAGE图(M：蛋白质marker；1-4：30℃诱导0h、4h、裂解上清、裂解沉淀；5-7：37℃诱导4h、裂解上清、裂解沉淀；8-11：16℃诱导0h、16h、裂解上清、裂解沉淀。箭头所示位置为表达的相应蛋白条带)

Fig.1PCR amplification ofLAC1 gene( M：DNA marker；1：LAC1gene)Fig.2Restriction enzyme of vector and fragment (M：DNA marker；1：pET-28a (+) plasmid；2：LAC1 gene)Fig.3PCR identification of the recombinant plasmid(-：negative control；+：positive control；M：DNA marker；1-3：single colony )Fig.4SDS-PAGE analysis of induction expression under different temperatures (M：protein marker；Lane 1-4：induced by IPTG 0 h ， 4h， supernatant of lysate， sediment of lysate under 30℃；Lane 5-7：induced by IPTG 4h， supernatant of lysate， sediment of lysate under 37℃；Lane 8-11：induced by IPTG 0 h ， 16h， supernatant of lysate， sediment of lysate under 30℃. The position indicated by the arrow is the corresponding protein band.)

图5表达蛋白超声裂解后MALDI-TOF质谱鉴定(M：蛋白质marker ；1：全菌液；2：裂解上清；3：裂解沉淀)图6包涵体变性溶解后的SDS-PAGE分析及MALDI-TOF质谱鉴定(M：蛋白质marker；1：水洗液；2：2 mol/L尿素第一次洗脱液；3：2 mol/L尿素第二次洗脱液；4：2 mol/L尿素第三次洗脱液)

Fig.5MALDI-TOF mass spectrometry of expression protein after ultrasonication (M：protein maker；Lane1：bacterial lysate of expression strain；Lane2：supernatant of lysate；Lane3：sediment of lysate)Fig.6SDS-PAGE analysis and MALDI-TOF mass spectrometry of inclusion bodies after denaturation and dissolution(M：protein maker；Lane 1：water；Lane 2：the first eluate of inclusion body protein dissolved by 2 mol/L urea ；Lane 3：the second eluate of inclusion body protein dissolved by 2 mol/L urea；Lane 4：the third eluate of inclusion body protein dissolved by 2 mol/L urea)

1998年，Ducros制备了来自灰盖鬼伞Ⅱ型Cu缺失型漆酶晶体Lac-Cc，这成为了第一个被衍射出来的漆酶晶体[13]，此后陆续有不同的有机体晶体三维结构被报道，其中大多数来自担子菌纲真菌孢子体。异源表达真核生物来源的漆酶表达宿主主要有细菌、酵母、丝状真菌和昆虫杆状细胞，大肠杆菌表达系统是目前广泛应用的蛋白质表达系统，具有遗传背景清、繁殖快、表达效率高等优点，但外源蛋白表达过程中易形成包涵体。包涵体是外源基因在细胞中表达量过高形成的一种膜包裹的高密度、不溶性蛋白颗粒，该蛋白不具有生物活性，其分子的空间结构表现为非折叠态的聚集体，复性后可恢复其生物活性[14]。目前，国内外关于新生隐球菌漆酶的研究主要集中在基因方面，如基因改变对漆酶产黑的影响[15-16]，暂无蛋白外源表达构建方面的研究。本实验在前期基因全合成过程中对DNA序列进行了针对大肠杆菌BL21的密码子优化，并在载体构建中引入了His-tag，His-tag在蛋白纯化中最为常见，其分子量小，对蛋白活性一般无影响，有利于蛋白的分离纯化。在His-tag的下游加入HRV3C酶识别位点，后期即可通过HRV3C酶对纯化的蛋白质进行切割，将His-tag切除，得到天然的目的蛋白。我们通过探索不同条件下目的蛋白的表达，如不同温度、不同的A600值、IPTG浓度、载体的种类，均未完全理想获得新生隐球菌漆酶蛋白的可溶性表达。用2mol/L尿素溶液处理沉淀后进行SDS-PAGE电泳及MALDI-TOF质谱检测，结果显示包涵体中存在目的蛋白的大量表达，后期可通过复性来进行下一步纯化分离试验。此外，在后续的纯化过程中若遇到蛋白活性等问题也可以尝试真核表达系统。

综上，本实验利用pET-28a(+)载体系统成功构建了含His-tag的新生隐球菌漆酶重组质粒pET-28a-lac，SDS-PAGE及质谱分析均可检测到目的蛋白表达，蛋白以包涵体的形式存在。这为后续进一步分离纯化目的蛋白并解析新生隐球菌漆酶晶体结构奠定了实验基础，从而研究发现漆酶的关键活性位点和重要功能区域。