R-藻红蛋白荧光标记小鼠抗人CD4/CD8单克隆抗体

高小娥

（武汉职业技术学院，湖北武汉 430074）

人T淋巴细胞表面分布不同的CD分子，其中CD4、CD8在临床诊断上有重要意义[1-2]。CD4+T淋巴细胞又称T辅助细胞（成年人的相对值43.8%±9.0%），CD8+T淋巴细胞又称T抑制细胞（正常成年人相对值31.3%±7.0%），它们的比值（1.5～1.7）：1，可以在一定程度上反映人体的免疫机能。同时，HIV的攻击对象正是人体的CD4细胞，HIV感染者可以导致机体内CD4+T淋巴细胞的绝对数量减少，CD8+T淋巴细胞数量增加，CD4+、CD8+的比例失调，因此，CD4+/CD8+的比值能够直接反映人体免疫功能，是提供HIV感染患者免疫系统损害状况最明确的指标[3-4]。国外在20世纪90年代已将CD4+T淋巴细胞计数和CD4+/CD8+比值测定作为HIV/AIDS的一项重要的诊断依据，中国从2001年起也将CD4+T淋巴细胞计数作为HIV/AIDS诊断的一项标准。通常是采用流式细胞术[5]结合免疫荧光标记抗体技术进行计数和比值的测定。

常用抗体标记的荧光素有PI、PE、FITC、PerCP、CY5等，其中PE是一种分子量极大的藻胆蛋白，由于其天生具有光合作用的分子片段，使其能将所吸收的光能最大限度地传输，被广泛应用于标记技术中[6-7]。PE因其吸收光波长不同分为R-PE（488nm）、B-PE（568nm）、APC（633nm），R-PE的分子量为240kD，激发波长488～560nm，发射波长595nm，其激发波长和发射波长不同，可以使它易于与FITC及内源性荧光分子相区别，并且能够在同一激发波长下，与其他荧光素同时标记检测不同分子。目前国内引进的大多数流式细胞仪只装有一个激光光源488nm光源，因此，选用能被488nm光源激发的R-PE荧光染料作为标记CD4/CD8单克隆抗体的荧光素。

1 材料与方法

1.1 材料

R-PE购自Sigma公司，DTT购自Sigma公司，DEMO购自Sigma公司，SPDP购自Pharmacia公司，SMCC购 自Fluka公 司，N-ethylmaleimide solution购自Fluka公司，CD4/CD8单克隆抗体来自武汉生物制品研究所，AKTAFPLC快速液相色谱系统，TU-1810型紫外分光光度计，等

1.2 实验方法

1.21 CD4/CD8单抗的纯化

采用辛酸-硫酸胺两步法+疏水层析纯化CD4/CD8单克隆抗体，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳证实提纯效果好，纯度大于95%。

1.2.2 R-PE标记CD4/CD8单克隆抗体

1.2.2.1 R-PE的预处理与质量检测

将保存在60%硫酸氨中的R-PE（共6mg，约2 mL），充分摇匀后，放入Eppendorf管中，12000r/min离心10min，弃上清。将沉淀重悬于0.5mLPBS中，用Sephadex-G25脱盐，洗脱液为0.02 mol/LPBS（pH7.5）。取1mL脱盐后的R-PE，加3mLPBS稀释，分别用紫外分光光度计测定其在280nm、565nm、620nm的吸光度。

1.2.2.2 R-PE的活化[9]

取 R-PE 3mg (约 2mL)，加入 6 µlSPDP (10mg/mL，溶DEMO中)，使SPDP与R-PE的摩尔比在10～15。室温孵育80min，加34mgDTT使之终浓度为50mmol/L，室温搅拌20min，对PBS透析24h。

1.2.2.3 CD4/CD8单抗的活化[10]

调整CD4/CD8单抗浓度为5mg/mL取1mL纯化后CD4/CD8抗体，加入15 μLSMCC(10mg/mL，溶于DEMO中)，使SMCC与单抗的摩尔比在10～15。室温孵育80min，对PBS透析24h。

1.2.2.4 CD4/CD8单抗的标记

将活化后的R-PE和活化后的CD4/CD8单抗混合，4℃搅拌过夜。

1.2.2.5 封闭

加入新鲜配制的6mg/mL N-ethylmaleimide solution，室温反应30min。

1.2.2.6 单抗标记物的纯化

将标记抗体通过S-300柱在AKTA监测下分离纯化，0.02mol/LPBS（pH7.5）洗脱，流速为1 mL/min，收集第一峰。

1.2.2.7 单抗标记物的保存

将收集的单抗标记物中加入BSA和叠氮纳，使终浓度分别达到1%和0.1%，在4℃避光保存。

2 结果与分析

2.1 单抗的纯化

用于制备PE标记的单抗要求纯度高（≥90%）。抗体纯化一般都采用硫酸铵两步法、辛酸-硫酸铵两步法和SPA-Sepharose柱亲合层析方法纯化。本实验中采用的是辛酸-硫酸铵两步法+疏水层析纯化CD4/CD8单克隆抗体，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实提纯效果好，纯度大于95%。

2.2 R-PE的质量要求

R-PE脱盐后，用紫外分光光度计在280nm、565nm、620nm的吸光度测定溶液，结果见表1要求A565/A280≥5.0，A620/A565≤0.02。

表1 吸光度检测结果

2.3 单抗标记物过SephacrylS-300柱的图谱

如图1所示，交联反应物共洗脱出3个蛋白峰。Sephaeryl S-300HR的排阻极限Mr 300 000，交联物的分子量约为400 000，R-PE的Mr 240 000，单克隆抗体Mr约150 000。根据筛分原理，交联物分子量高于排阻极限，首先洗脱下来。因此峰1是R-PE和CD4/CD8单抗的交联产物，峰2是游离而未交联的R-PE，峰3是多余的CD4/CD8单克隆抗体。

图1 抗CD4/CD8 单抗-PE凝胶过滤层析图

2.4 FACS分析结果

表2 标记抗体检测人外周血单个核细胞CD4、CD8表达情况anti-CD4检测结果

图2 FACS分析正常人外周血CD4、CD8细胞图

如表2所示，标记抗体检测的CD4和CD8分子在正常人外周血单个核细胞中的比例分别为47.49%、32.73%，符合正常人外周血单个核细胞正常值范围即CD4为（43.8±9.0）%，CD8为（31.3±7.0）%，且特异性保持完好，荧光强度较高。

3 讨论与小结

3.1 单抗纯度对标记结果的影响

用于制备PE标记的单抗要求纯度高(>95%)。抗体纯化一般都采用硫酸铵两步法、辛酸-硫酸铵两步法和SPA-Sepharose柱亲合层析方法纯化。本实验中采用的是辛酸-硫酸铵两步法+疏水层析法纯化CD4/CD8单克隆抗体，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实提纯效果好，纯度达到96%。

3.2 R-PE和抗体的交联比例对标记结果的影响

R-PE和抗体的交联比例也是标记成功与否的关键因素之一，分别采取了1:1、1:2、2:1、3:1四种不同的比例进行交联，结果显示，R-PE和CD4/CD8单抗在1：1的比例交联，其交联的抗体特异性保持完好，非特异偶联少且荧光强度较高，可重复性好。

3.3 R-PE的质量对标记结果的影响

R-PE的质量在标记中是极为重要的。其保存条件、温度及使用期限对它的质量都有影响。文献显示，用于标记的R-PE要求A565/A28≥5.0，A620/A565≤0.02，因此，本实验在开始之前，对购买的R-PE商品进行预处理和质量检测，结果显示R-PE经检测 A565/A280=5.2058、A620/A565=0.014，满足标记要求。

本实验使用异双功能交联试剂SPDP和SMCC分别活化R-PE和CD4/CD8单克隆抗体，将活化后的R-PE和CD4/CD8单抗以摩尔比1:1的比例交联，能得到具有良好荧光强度和特异性的偶联单抗，具有一定的普适性，但R-PE和抗体的利用率，即交联产率还有待进一步提高。

4 结论

用于制备标记的单抗纯度和R-PE的质量，交联剂的使用，单抗和R-PE的交联比例以及反应时间和温度都对交联效果有影响。合理的控制这些条件，就可以提高交联效率。