2,4-二氯苯氧乙酸在线免疫传感器监测技术的应用研究

余琼珍, 张铖麟, 朱志华, 崔婉俊,刘广立*, 宋保栋, 王 伟, 叶 波

(1.肇庆市环境保护监测站(肇庆市环境科学研究所),广东,肇庆 526040;2.中山大学 环境科学与工程学院,广东,广州 510006; 3.北京金达清创环境科技有限公司,北京 100084)

0 引 言

2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)是一种广泛应用的含氯除草剂和植物生长调节剂,2,4-D自然条件下不易生物分解,水中溶解度较高,易通过自然循环途径进入生态系统[1-2].通常2,4-D作为除草剂用量可达500 mg/L,作为植物生长调节剂用量可达30 mg/L[3].2,4-D已被确认为是一种环境内分泌干扰物,可在生物体内积累并损伤组织器官,如肾脏、肝脏和脑组织,严重危害人体健康[2],因此不仅在我国水果和蔬菜中2,4-D的残留量受到《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》(GB 2760—2011)[4]严格限值,而且在我国《生活饮用水卫生标准》(GB 5749—2006)中明确规定2,4-D的质量浓度限值为30 μg/L[5].对于低质量浓度2,4-D的检测,目前主要以色谱法为主,如液相色谱、气相色谱、液质联用、气质联用等[3-4,6-8],虽然灵敏度高,但仪器设备昂贵,操作繁琐,且对技术人员素质要求较高,难以实现批量大规模的快速检测.随着生物技术的发展,酶抑制、免疫分析和分子印迹方法测定技术逐步发展起来[5,9-12],特别是免疫分析技术,将抗体或抗原作为特定的感测元件,通过检测特定抗原-抗体在载体表面结合中的反应[13-14],根据光电信号的变化,即可检测2,4-D的质量浓度.该方法具有特异性强、方便快捷、成本低等优点,从而受到国内外的广泛关注[15-16].

珠三角地区农业生产发达,水网密布,在农业生产过程中使用的农药极易进入河道水环境系统[17],而广东省饮用水水源地多为地表水,在珠江主干流西江磨刀门水道附近的监测结果表明,多种农药的质量浓度在部分时段虽然未超出我国水质标准,但已超出欧盟饮用水水质中相关标准[18],存在较大的农药污染和安全风险隐患,因此水环境中农药残留浓度的监测和预警对于保障饮用水水质安全具有重要的意义.西江肇庆段水质良好,一直是广州、深圳、佛山等城市的重要优质河流型饮用水水源之一[19-20],为了实现对有机农药的在线预警,本文作者开展了以2,4-D为监测对象,对在线免疫传感器监测进行了相关研究,为长期且连续实现西江肇庆段水质有机农药预警提供参考.

1 材料和方法

1.1 2,4-D在线免疫传感器系统

2,4-D在线免疫传感器由北京金达清创环境科技有限公司提供[21],主要包括进样系统、免疫芯片、激光器、多路信号采集与光电转换系统、数据采集与处理单元共5部分组成.免疫荧光传感芯片是基于免疫学反应原理,采用硅烷化试剂加高分子聚合物对2,4-D免疫芯片进行修饰制备而成,对2,4-D特异性抗体有很强的特异性响应,通过检测免疫传感器的光电信号大小,可实现2,4-D的定量监测[22-23].具体制备制作过程略.

1.2 主要试剂

主要试剂包括:2,4-D标样(100 μg/mL,北京中科质检生物技术有限公司);质量浓度0.5%的十二烷基硫酸钠溶液(pH=1.9,广州化学试剂厂);磷酸盐缓冲溶液(pH=7.6,广州化学试剂厂);去离子水(实验室自制).

1.3 标准曲线

样品测试之前,需要根据标准样品确定其工作的信号强度—抗原质量浓度关系曲线,即标准曲线.免疫检测技术的标准曲线可用Logistic模型模拟,即:

(1)

式中:Y为有效信号值;A1和A2分别为最大和最小效信号值;x为待测样品中抗原质量浓度(单位:μg/L);x0为半抑制质量浓度(单位:μg/L);p为拐点处切线斜率.

在本实验中,采用系列2,4-D标准质量浓度:0.033,0.100,0.300,1.000,10.000,20.000,33.000,50.000,66.000,100.000,200.000,500.000 μg/L进行测试,测试步骤为:1) 去离子水清洗3次;2) 标准质量浓度样品测定;3) 去离子水清洗3次,然后进入下一个样品质量浓度的测定,每个样品质量浓度测试一次的时间约为30 min,最终根据测定的结果,画出Logistic拟合曲线,确定在线分析的有效测定范围.

1.4 记忆效应测试

考虑到实际水样中2,4-D的质量浓度在不断发生变化,有可能出现高浓度冲击负荷的情况,在含高浓度2,4-D的水样与免疫芯片反应后,有可能会影响后续的测定,需要考虑如何消除因冲击负荷的影响而带来的误差;此外在紧急情况下,需要考虑对实际水样每天进行多次分析,如何实现多次分析的测定结果准确度等.因此针对上述问题开展了记忆效应测试.即选取低标(10 μg/L的2,4-D标准溶液)和高标(100 μg/L的2,4-D标准溶液),模拟实际水样测定中的高浓度冲击负荷的影响(空白—高标—空白),及多次分析测定的影响(低标—高标—低标).间歇地将待测试样品送至仪器,且让仪器连续工作,每个样品测定时间为6～8 min,测定完成后,马上进行下一个样品的测试,以模拟实际测定中仪器连续工作的信号响应结果,分析其与实际值之间的差异.

1.5 比对实验测试

为了进一步考察2,4-D在线免疫传感器测试的稳定性及可靠性,通过配置不同质量浓度的2,4-D标准溶液(15.0,22.5,25.0,40.0,60.0,80.0 μg/L),共计48组,每组2个水样,其中1个水样进行2,4-D在线免疫传感器的直接测定,另1个水样送至具有质量认证资质的某中心进行人工高效液相色谱方法的盲测,对比两者以确定2,4-D在线免疫传感器的性能.

1.6 西江水连续运行测试

在西江肇庆三榕峡水质自动监测站(西江肇庆段三榕水厂取水口上游300 m处),安装2,4-D在线免疫传感器,传感器位于自动监测站室内,西江水的待测水样由位于西江河道中安装的潜水泵抽取,潜水泵取样点的平均水位为17.5 m,水流流速平均为1.7 m/s,经潜水泵抽取的水样通过27 m长的管道直接输送至自动监测站室内,配送至水样储备槽(体积约10 L),然后由2,4-D在线免疫传感器的进水取样器抽取水样储备槽中的西江水进行测定分析,以研究免疫传感器的信号响应及测定结果.2,4-D在线免疫传感器运行方式为晚间每2 h测定一次,白天每0.5 h测定一次.

2 结果与分析

2.1 标准曲线分析

2,4-D在线分析仪的Logistic曲线测定结果如图1所示,可以看出Logistic曲线方程为:

(2)

图1 2,4-D在线免疫传感器的Logistic曲线测定结果

相关性系数R为0.9967,因此Logistic曲线方程能够很好地描述免疫芯片抗原对2,4-D的响应过程.系统对2,4-D的检测限可达0.033 μg/L,但从定量响应范围看,在10 ～ 200 μg/L内具有良好的半对数线性关系(y=-4166 lnx+26460),相关系数R达0.9915.因此2,4-D在线分析仪可实现在10 ～ 200 μg/L内对2,4-D的精确测定,考虑到我国《生活饮用水卫生标准》(GB 5749—2006)中2,4-D的质量浓度限值为30 μg/L,采用2,4-D在线分析仪实现对水质的预警监测是可行的.

2.2 记忆效应分析

图2 2,4-D在线免疫传感器的记忆效应测试结果.(A)空白—高标—空白;(B)低标—高标—低标

不同条件下2,4-D在线分析仪的记忆效应实验结果如图2所示,从图2中可以看出,当采用空白—高标—空白模式时,2,4-D在线分析仪能够实现对2,4-D的信号精确响应,连续3次测定值分别为99.3,102.1和106.5 μg/L,与理论值100 μg/L吻合度高,3次测量的平均相对误差为2.6%,用去离子水进行的连续空白测定结果平均值为3.8 μg/L;当采用低标—高标—空白模式时,在线分析仪仍然能够对高标浓度实现较准确的测定,3次测定值分别为98.3,108.0和109.1 μg/L,3次测量的平均相对误差为5.2%,但随后测定低标10 μg/L样品时,误差较大,3次测定平均值为17.4 μg/L.因此可以认为在线分析仪存在一定的记忆效应,需要在实际运行中多次冲洗荧光芯片,以减轻高浓度2,4-D测定对后续低浓度样品的影响.

2.3 比对试验结果分析

比对48组不同质量浓度2,4-D的双盲测定,即2,4-D在线分析仪与标准实验室人工测定,结果如图3所示.从图3中可以看出,在2,4-D质量浓度分别为15.0,22.5,25.0,40.0 μg/L的条件下,在线分析仪能够实现稳定准确的测定,平均相对误差为4.0%;而标准实验室人工测定值的平均相对误差为13.0%;当2,4-D质量浓度分别为60,80 μg/L的条件下,在线分析仪测定值的平均相对误差为12.0%,而人工测定值的相对误差为5.6%.48组样品的整体平均相对误差,在线分析仪为6.6%,而人工测定为11.0%.特别是在2,4-D质量浓度为15和80 μg/L时,人工测定出现了多次重大的偏差,盲测的水样中2,4-D质量浓度测定结果为0.分析原因除了人工多次测定误差外,也有可能是由于取样再送至实验室进行人工测试,过程繁琐且耗时长,存在样品瓶泄漏或者污染等因素.不管怎样,在多次大量数据分析测定中,虽然在线分析仪存在误差,甚至相对高的误差,但人工测定引起的误差则有可能会大大高于仪器,因此开发水质在线监测分析仪器对于实现水环境质量的安全预警,具有重要意义.对于2,4-D在线分析仪连续多次存在的误差,可能来源于芯片的记忆效应干扰,也可能是芯片的稳定性仍有待于进一步提高.

图3 2,4-D不同测定方法的比对实验结果

2.4 西江水实际运行结果分析

西江肇庆三榕峡水质自动监测站处水质优良,达到地表水II类标准,长期的人工监测分析表明,水中农药类物质质量浓度极低,其中2,4-D的质量浓度在该处远远低于国家标准,一直在检测线以下.在该监测站进行了为期2个月的连续运行(2018年4月1日—5月31日),2,4-D在线免疫传感器系统获得的2,4-D质量浓度在其检测限以下,仪器显示值为0,与实际情况相符,未出现系统报警现象.

综合上述结果,2,4-D在线免疫传感器能够实现对水环境中2,4-D的大量快速检测,有望在实际应用中推广,实现水环境质量预警监测的作用.

3 结 语

2,4-D在线免疫传感器对2,4-D浓度的响应符合Logistic曲线方程,在10～200 μg/L的2,4-D浓度范围内,在线免疫传感器的信号响应可符合半对数线性方程.免疫芯片存在一定的记忆效应.48组测定比对实验表明,在线免疫传感器的测定误差小于人工测定误差,2,4-D在线免疫传感器可用于西江水的监测,运行稳定,信号可靠,为实现水环境有毒有害有机物的在线监测预警提供了一种新的技术解决方案.