枯草芽孢杆菌发酵芝麻香白酒酒醅制备抗氧化活性肽

姬中伟，陈翔，孔小勇，周新虎，毛健*

1(江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡 214122) 2(江苏洋河酒厂股份有限公司，江苏宿迁 223800)

酒醅是白酒窖池中发酵的固体物料，含有多种营养物质以及微生物代谢产生的非挥发性物质等，主要包括粗淀粉、粗蛋白、粗纤维、粗脂肪、氨基酸、维生素和其他微量元素等。

高级醇是3个碳以上的一元醇类物质的总称，具有沸点高、挥发性强的特点[1]。适量的高级醇一方面可以使酒体醇甜，另一方面，它还可以与酸酯化生成酯类物质，使酒体丰满[2]；但是，若其浓度过高，非但不能表现出呈香、呈味的效果，反而会给酒体带来诸多不好的风格，如苦、涩、冲辣等。另外，其含量过高也会对人体造成一定的危害，这是因为高级醇若代谢时间较长，会抑制神经中枢，容易导致饮酒者深醉，出现“上头”等不良体验[3]。总体而言，高级醇的含量要控制在适当的范围内，不可过高[4]。

在固态白酒发酵过程中，高级醇由发酵原料或酵母菌体蛋白质经一系列生化反应生成。降低白酒发酵过程的高级醇有多种方法，其中通过添加蛋白酶增强分解蛋白的能力就是方法之一，有研究报道，在固态白酒发酵中，增加蛋白酶量，增加氨基酸含量,可以减少发酵中杂醇油的生成[5]。

当前，通过固态发酵豆粕、核桃粕、菜籽粕等原料来制备活性肽的方法已有报道[6-10]。常用的发酵菌种有枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌等[11-12]，另外，也有少数采用乳酸菌及酵母菌发酵的报道[13]，相关研究结果表明，发酵豆粕中高分子量蛋白质含量下降，低分子蛋白质含量提高。

白酒酒醅同样含有较高含量的蛋白质，江苏洋河酒厂的芝麻香型白酒的生产原料中含有较高比例的豆粕，因此蛋白含量更高。本研究考虑利用高产酸性蛋白酶的枯草芽孢杆菌对芝麻香型白酒酒醅进行固态发酵，分解蛋白制备小分子肽，为降低产品中的高级醇含量提供一种新的参考方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验所用浓香型和芝麻香型酒醅由江苏洋河酒厂提供；枯草芽孢杆菌YH-1003，由本实验室筛选并保存； DPPH和ABTS试剂购自Sigma公司；其他试剂均为国药集团分析纯试剂。

培养基：(1)种子培养基(LB培养基g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10；(2)固体平板培养基(g/L)：蛋白胨4，酵母粉2.5，琼脂18，脱脂奶粉12；(3)发酵培养基(g/L)：玉米粉40，豆粕粉30，麸皮30，Na2HPO44，K2HPO40.3。上述培养基在121 ℃灭菌15 min。

1.2 仪器与设备

Amicon Ultra-15超滤管(3 kDa)，Millipore公司；5804R离心机，德国Eppendorf公司；K9840自动凯氏定氮仪，济南海能仪器股份有限公司；Agilent 1260高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；Beta 2-8 LDplus冷冻干燥机，德国Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 酒醅主要成分的测定

参照国家标准测定[14-16]。酒醅水分的测定按国标GB/T 6435—2014所述方法，即称取酒醅后烘干至恒重，计算酒醅损失质量与酒醅质量的百分比；酒醅中粗蛋白含量按国标GB 5009.5—2016中所述凯氏定氮法进行检测，其中换算系数为6.25；酒醅中粗淀粉含量按国标GB/T 5009.9—2008所述酸水解方法进行检测，即称取酒醅，利用石油醚和乙醇清洗后，沸水回流条件下HCl水解2 h，之后在甲基红指示剂下由HCl溶液进行滴定。取3份样品作为平行样品，结果用平均值表示。

1.3.2 枯草芽孢杆菌的培养

(1)菌种的活化：将保存于甘油管中的枯草芽孢杆菌接种于含有50 mL种子培养基的250 mL锥形瓶中，在30 ℃、200 r/min条件下培养12 h；之后将锥形瓶中的菌种转接至固体平板中，30 ℃倒置培养24 h，将长出的单菌落挑取并接种于含有50 mL种子培养基的250 mL锥形瓶中，在30 ℃、200 r/min条件下培养12 h后用于接种。

(2)扩大培养：将活化的枯草芽孢种子培养液以3%接种量接种于含有100 mL发酵培养基的500 mL锥形瓶中，在30 ℃、200 r/min条件下培养24 h，用于酒醅固态发酵。

1.3.3 枯草芽孢杆菌固态发酵酒醅的工艺流程

称取10 g烘干的芝麻香型酒醅加入10 mL蒸馏水，混合后加入250 mL锥形瓶中，121 ℃灭菌15 min，冷却后接入0.2 mL/g枯草芽孢杆菌菌液(约108CFU/mL)，30 ℃下培养48 h，其中每隔12 h振荡锥形瓶1次。发酵结束后，将酒醅置于平皿中50 ℃烘干至恒重，以干物质质量加入相同质量的蒸馏水，浸湿后在30 ℃下超声萃取30 min，之后在8 000×g离心10 min，取上清液于0.45 μm滤膜过滤后，利用3 kDa超滤膜进行超滤分离，得到的小分子肽液冷冻干燥保存。

1.3.4 酒醅固态发酵条件的单因素试验

在1.3.3固态发酵工艺的基础上，本研究对发酵温度、发酵时间、固态发酵含水量进行了单因素试验，其中发酵温度选择27、30、33、36、40 ℃、发酵时间分别为24、36、48、60、72 h，含水量选择0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL/g。固态发酵结束后，按1.3.3所述方法对小分子肽分离提取，并检测在不同条件下得到的肽产品含量(直接测定超滤所得滤液中的肽浓度)。

1.3.5 响应面优化试验设计

在单因素试验结果的基础上，以发酵温度、发酵时间、料液比和接种量作为考察因素，以肽含量为指标，用Design Expert 8.0.6软件Box-Benhnken中心组合进行优化试验设计，试验因素及水平见表1。

表1 响应面优化中的因素和水平Table 1 Coded values of single factor in responsesurface methodology

1.3.6 酒醅肽含量

取3 mL工艺优化后发酵的肽与3 mL 100 g/L三氯乙酸溶液混合，静置30 min后在8 000×g离心20 min，1 mL上清液中加入1 mL碱性铜溶液后，再加入4 mL福林酚溶液，经55 ℃水浴5 min后，于650 nm波长下检测吸光值，检测值代入不同浓度牛血清白蛋白绘制的标准曲线,求得肽浓度[18]。

1.3.7 酒醅肽的分子质量分布及氨基酸组成[17]

采用优化的固态发酵工艺条件，得到酒醅肽溶液，经三氯乙酸沉淀离心，上清液经0.45 μm滤膜过滤后，利用高效液相色谱仪检测肽的分子质量分布，根据不同分子质量肽标品在液相中保留时间的不同，检测酒醅肽的分子质量分布，同时以不同分子质量肽的峰面积计算不同肽的含量比例。

氨基酸检测：将4 mL酒醅肽溶液与4 mL浓HCl混合，水解管中充N2后在120 ℃烘箱中水解24 h，之后用10 mol/L NaOH溶液中和并用蒸馏水定容至50 mL，双层滤纸过滤后，滤液在10 000×g离心30 min，上清液经0.22 μm滤膜过滤后用于高效液相色谱仪检测氨基酸种类和含量。

色谱条件：色谱柱superdex peptide 10/300 GL(10 mm×300 mm) 凝胶柱; 流动相为0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH=6. 0，含有0.1 mol/L NaCl); 流速为0.7 mL/min; 柱温25 ℃; 检测波长214 nm。

1.3.8 酒醅肽的抗氧化活性

(1)DPPH自由基清除率[18]：以去离子水为溶剂将冻干的酒醅肽配制成溶液。取2 mL不同浓度酒醅肽溶液与2 mL DPPH溶液(0.14 mmol/L溶于乙醇)，室温避光静置30 min后在517 nm波长检测吸光值，DPPH自由基清除率按公式(1)计算：

(1)

式中：A0为2 mL去离子水与2 mL DPPH溶液混合后的吸光值；A1为2 mL样品与2 mL DPPH溶液混合后的吸光值；A2为2 mL样品与2 mL乙醇混合后的吸光值。

(2)清除ABTS自由基[18]：将ABTS溶液与过硫酸钾配制为ABTS·+母液，使用前稀释至波长734 nm下吸光值为0.7左右，将0.15 mL酒醅肽溶液与2.85 mL ABTS·+溶液混合，室温避光静置10 min后在波长734 nm下检测吸光值，ABTS自由基清除率按DPPH公式计算。

1.4 数据分析

本研究中检测分析数据均为3个平行样品，以平均值和方差表示，利用GraphPad Prism 7软件绘图。Plackett-Burman试验设计和响应面分析优化采用Design-Expert 8.0.6软件。

2 结果与分析

2.1 酒醅主要成分分析

2种酒醅在含水量和粗淀粉较为接近，而在粗蛋白含量中具有较大差异，其中，由于芝麻香型酒醅含有较高比例的豆粕，其粗蛋白含量约为13.5 g/100 g酒醅，是浓香型酒醅粗蛋白含量的2.5倍(表2)。本研究选择芝麻香型酒醅作为固态发酵产肽的原料。

表2两种酒醅的主要成分含量

单位：g/100g

2.2 枯草芽孢杆菌固态发酵酒醅生产小分子肽的单因素试验

利用本团队前期筛选得到的产酸性蛋白酶枯草芽孢杆菌对芝麻香型酒醅进行固态发酵，并利用响应面方法对固态发酵条件进行优化。

2.2.1 发酵温度对酒醅肽含量的影响

发酵温度为27 ℃时提取得到的肽含量为4.45 mg/mL，当发酵温度升高至30 ℃时肽的含量达到最高为5.83 mg/mL，超过30 ℃后肽含量开始下降，在发酵温度达到40 ℃时肽含量仅为1.02 mg/mL(图1)。枯草芽孢杆菌属于细菌的一种，其生长、产酶能力及酶学性质受温度影响大。因此，在较高培养温度下酒醅肽含量的降低，可能是由于在较高温度下菌体产酶和所产酸性蛋白酶水解能力的下降，导致酒醅肽含量的降低。

图1 发酵温度对枯草芽孢杆菌固态发酵产肽的影响Fig.1 Effect of culture temperature on peptides productionin solid state fermentation of BFG by B. subtilis

2.2.2 发酵时间对酒醅肽含量的影响

发酵时间由24 h延长至48 h时，酒醅肽含量由2.54 mg/mL增加至7 mg/mL(图2)。在固态发酵48 h后，随时间的增加肽含量开始下降，72 h时肽含量为4.5 mg/mL。在一定的时间范围内，发酵时间的延长有利于蛋白酶水解产生肽，这主要是由于发酵时间的延长提高了发酵中的菌体量和微生物代谢产生的蛋白酶含量，从而有效水解固态发酵基质中的蛋白质并形成小分子肽[6]。但过多的蛋白酶积累并不利于积累肽，因为蛋白酶的过量存在将导致水解形成的肽再次被水解成为更小的肽或直接水解为氨基酸，因此表现为小分子肽含量的下降。

图2 发酵时间对枯草芽孢杆菌固态发酵产肽的影响Fig.2 Effect of culture time on peptides production insolid state fermentation of BFG by B. subtilis

2.2.3 含水量对酒醅肽含量的影响

含水量为0.6 mL/g时酒醅肽含量最低，为2.48 mg/mL，当含水量由0.6 mL/g提高至1.2 mL/g时，肽含量随之增加，在1.2 mL/g时肽含量达到最高的6.42 mg/mL，之后开始下降(图3)。

图3 含水量对枯草芽孢杆菌固态发酵产肽的影响Fig.3 Effect of moisture on peptides production insolid state fermentation of BFG by B. subtilis

2.3 酒醅固态发酵条件的响应面优化

2.3.1 响应面优化试验

根据单因素优化试验的结果，按照表3中所述条件进行响应面优化试验。

得到酒醅肽含量(Y)对发酵温度(X1)、发酵时间(X2)和含水量(X3)之间的多元回归方程为：

Y=-180.292+9.016X1+1.210X2+41.794X3-0.013X1X2+0.246X1X3-0.083X2X3-0.146X12-0.007X22-19.375X32

表3 响应面优化试验Box-Behnken设计及结果Table 3 Box-Behnken design with experimental andpredicted T-AOC values

2.3.2 响应面结果分析

表4 回归方程各项方差分析Table 4 Analysis of variance for the response surfacequadratic model

2.3.3 响应面试验的理论值及验证试验

利用三维曲面分析了发酵温度、发酵时间和含水量三条件之间的交互影响，结果显示发酵温度和发酵时间的交互影响最为显著。通过响应面的分析在选定的条件范围内，适当提高三因素的水平可有效提高酒醅肽的得率。通过对多元回归方程求解，得到酒醅固态发酵的最优条件为：发酵温度29.84 ℃、发酵时间46.83 h、含水量1.19 mL/g，此条件下酒醅肽含量预测值为7.24 mg/mL。在验证试验中，本研究将发酵条件调整为：发酵温度30℃、发酵时间47 h、含水量1.2 mL/g。在此条件下发酵并提取得到的酒醅肽含量为7.06 mg/mL，相对误差约为3.74%，对比未优化前对照条件下的5.83 mg/mL，酒醅肽含量提高了1.2倍。因此，本研究利用响应面优化方法有效提高了酒醅肽的产量。

2.4 酒醅肽的分子质量分布与氨基酸组成

酒醅肽在液相中根据保留时间的不同可以分成7个峰，其中分子质量在2 000～1 000 Da和1 000～500 Da的肽占比分别为41.56%和15.05%(表5)。此外还含有少量高于2 000 Da的肽，但在酒醅肽溶液中含量较少，占比约为10%左右。在肽样品中同样检测到分子量较低的样品(<180 Da)，这部分样品可能主要是被过量水解而积累的氨基酸。

本研究还对酒醅肽中的氨基酸组成及含量进行了检测和分析。在检测到的17种氨基酸中(图4)，含量最高的是谷氨酸(Glu)，达到1 970 mg/L，其次是含量为1 274 mg/L的天冬氨酸(Asp)，含量在500～800 mg/L范围内的氨基酸包括精氨酸(Arg)为745.6 mg/L、亮氨酸(Leu)为696.2 mg/L和酪氨酸(Tyr)为516.1 mg/L。人体必需8种氨基酸中，苯丙氨酸(Phe)和甲硫氨酸(Met)含量较低，分别为2.88和11.88 mg/L，其余6种氨基酸含量在200～800 mg/L范围内。

图4 酒醅肽中的氨基酸种类和含量Fig.4 The composition and content of amino acids inpeptides produced from Baijiu Fermenting Grains

2.5 酒醅肽的抗氧化活性

酒醅肽质量浓度在0.3 mg/mL以上时对DPPH自由基的清除能力要明显高于ABTS自由基(图5)。在考察DPPH自由基清除能力时，当酒醅肽质量浓度达到0.4 mg/mL时清除率达到85.5%，之后清除率保持稳定直至最高肽质量浓度(0.6 mg/mL)；而ABTS具有相似的清除能力趋势，在0.4 mg/mL时酒醅肽对ABTS自由基清除率为66.2%，之后基本保持稳定。

图5 不同质量浓度酒醅肽的DPPH和ABTS自由基清除率Fig.5 DPPH and ABTS radical scavenging activity ofvarious concentrations of BDG peptides

酒醅肽的抗氧化活性与其分子质量分布及氨基酸组成密切相关。豆粕固态发酵所得到的分子质量在2 kDa以下的小肽具有较高的抗氧化活性[19]。另外，本研究所得到的酒醅肽中酪氨酸、赖氨酸等氨基酸含量较高，这些氨基酸本身就具有较强的抗氧化能力[20]。

3 结论

本研究通过对固态发酵条件进行优化后，肽含量最高可达到7.04 mg/mL，同时酒醅肽分子质量较多分布在低于2 000 Da，较低分子质量可能是酒醅肽具有良好自由基清除能力的原因，在0.4 mg/mL下对DPPH和ABTS自由基具有良好的清除率，显示了良好的抗氧化活性。本研究结果表明，芝麻香型酒醅在固态发酵的条件下能够产生具有抗氧化活性的小分子肽，这为降低酒醅蛋白含量从而调控产品中的高级醇提供了一种参考的途径。