高表达p27基因对子宫颈癌HeLa细胞增殖的影响研究

王晓慧 阮 杰 罗苏亚

子宫颈癌为临床上发病率较高的一种肿瘤疾病[1]，研究显示[2]，多种肿瘤疾病患者均伴有程度不一的p27表达水平下降现象，例如子宫颈癌、甲状腺癌等，且患者肿瘤恶性程度和蛋白表达阳性率通常有较大关联。为探讨p27基因表达对子宫颈癌的影响，本研究中以构建p27高表达HeLa细胞株的方式进行研究，详细报告如下：

1 材料与方法

1.1 材料 实验前做好各项材料准备，包括真核表达载体pcDNA（购自Novagen公司）、工具酶（购自Fermentas公司）、EPLCS XL流式细胞分析仪（购自Becman Coulter公司）等。

1.2 方法

1.2.1 pcDNA3.1（+）-p27真 核 表 达 载 体 构建 2018年3月1日起，收集HeLa细胞，收集时间为其对数生长期；收集后进行总RNA提取，提取时可借助Trizol试剂进行，以提取的总RNA为模板，然后利用逆转录酶与OLiGo20引物合成cDNA，并利用PCR技术进行扩增，并利用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，并以试剂盒进行纯化回收，然后利用25uL TE进行溶解备用。利用限制性内切酶EcoRI于Xh0I对纯化回收的p27目的片段及真核表达载体pcDNA3.1（+）进行消化，并对酶切的目的片段、载体进行纯化回收，然后以3:1方式进行链接。对产物转化克隆DH5a进行链接，然后利用LB琼脂板筛选，随机取单克隆细菌与体质粒DNA行限制性酶切、DNA测序鉴定。

1.2.2 细胞培养及p27基因转染、鉴定 将人子宫癌HeLa细胞株在5% CO2，37 ℃湿化孵箱内培养，并利用脂质体介导法将pcDNA3.1（+）-p27重组质粒导入HeLa细胞内，并利用G418进行筛选，并对pcDNA 3.1质粒进行转染，并以此为对照。利用免疫印迹法、RT-PCR对p27高表达的阳性HeLa细胞株进行鉴定。

1.2.3 细胞生长速率测定及细胞周期分析 将对数生长期各组细胞制成单细胞悬液，并对其细胞浓度进行调整，然后在96孔板内接种，不同种细胞分别接种三组，然后置于CO2培养箱内进行培养，培育时间分别控制为1 d、2 d、3 d；然后将培养液完全弃掉，并在每孔内加入2 g/L MTT 100 uL，再培养4 h。之后弃尽孔内培养液，并在每孔内加入100 uL DMSO振荡30 min，对570 nm波长部位的光吸收值进行测定。然后将各组细胞制成单细胞悬液，并利用PBS冲洗，并重悬于PBS混合液内，并在4 ℃的环境下固定60 min。之后行离心运动，然后以PBS混合液进行处理，将其转至测定管中，并以碘化丙锭染液进行为期30 min的染色处理，然后以流式细胞仪行细胞流式计数分析。

1.3 统计学分析 SPSS 20.0统计学软件分析数据，计量资料采用独立样本t检验，计数资料行χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 p27cDNA克隆及高表达p27HeLa细胞株鉴定 本研究成功获取p27高表达HeLa细胞株，且PCR产物经琼脂糖凝胶电泳处理可见约600bp部位有一条DNA条带，而未加模板的空白对照孔则无相应条带；并成功构建pcDNA3.1（+）-p27真核表达载体。且经免疫印迹法、RT-PCR对细胞株进行鉴定获得高表达p27基因细胞两株，以此为La-cl、HeLa-c2；转染空载体pcDNA3.1（+）细胞株为HeLa3.1（见图1）。

图1 RT-PCR鉴定p27高表达HeLa细胞株

2.2 p27高表达对HeLa细胞增殖的影响 利用MTT法 对HeLa、HeLa3.1、La-cl、HeLa-c2四 组对数生长期的细胞进行生长速度测定，结果显示48 h时HeLa、HeLa3.1、La-cl、HeLa-c2的生长速率 分 别 为1.15、1.12、0.75、0.59；HeLa、HeLa3.1的生长速率明显高于La-cl、HeLa-c2（P＜0.05）。且经流式细胞分析显示，高表达p27基因的HeLaG1期细胞数显著增加，S期细胞明显降低，见表1。

表1 p27高表达对HeLa细胞增周期的影响

3 讨 论

子宫颈癌为临床上发生率较高的一种肿瘤疾病，对患者健康及生命安全的威胁极大[3]。而正常细胞生长、肿瘤发生发展过程中，细胞周期素均有着不可或缺的作用。细胞周期素依赖性激酶则在细胞周期进展的调节中发挥着非常重要的作用[4]。因此，目前临床上通常将其作为治疗肿瘤关键。

细胞内细胞周期素依赖性激酶极易受细胞周期素依赖性激酶抑制剂（CDKIs）等多种因素的影响[5]。故而，临床上必须要加强对CDKIs的研究。p27基因属于细胞周期素依赖性激酶抑制剂的一种，其与多种cyclin-CDK复合物均可产生一定的作用，从而达到抑制CDK活性的效果[6]。且研究显示[7]p27还属于抑癌基因的一种，其可有效的对细胞的分化情况进行诱导，有利于促进细胞凋亡，并可对肿瘤的耐药性进行调节，同时可发挥防御炎性损伤的功效。且有研究显示[8]：多种肿瘤疾病患者均伴有程度不一的p27表达水平下降现象，且患者肿瘤恶性程度和蛋白表达阳性率通常有较大关联。且临床研究表明，子宫颈癌HeLa细胞内可见p27基因表达明显下降，而基因启动子区则可见甲基化状态[9]。因此，本研究中通过构建p27高表达HeLa细胞株的方式对p27基因表达与子宫颈癌的关系进行了研究。结果显示本研究成功获取p27高表达HeLa细胞株，且p27基因高表达还可发挥细胞增殖抑制功效，并可促使G1期细胞数显著增加。提示p27基因高表达可对HeLa细胞增殖情况产生一定的影响。

综上所述，HeLa细胞中p27基因高表达可在一定程度上对细胞增殖现象进行抑制，且p27基因可作为子宫颈癌基因治疗的靶基因。