黄曲霉毒素B1降解菌的分离、鉴定及其降解能力研究

王明清，于丽娜，张初署，徐念均，殷登科，唐佩显，毕 洁，孙 杰，赵善仓，张智猛

(1.山东省花生研究所，山东 青岛 266100； 2.西海岸现代农业示范区管委会，山东 青岛 266400；3.胶南市种子公司，山东 青岛 266400；4.山东省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，山东 济南 250100)

黄曲霉毒素(Aflatoxin)是一类主要由黄曲霉(Aspergillusflavus)、寄生曲霉(A.parasiticus)、集蜂曲霉(A.nomius)、溜曲霉(A.tamarii)等真菌产生的次级代谢物[1]。该类毒素是由二呋喃环和香豆素组成的结构类似物，具有强肝毒性、致突变性、致癌性、致畸性[2]。黄曲霉毒素污染的范围比较广泛，如花生、玉米、干果、牛奶等食品，因其毒性强，越来越受到关注。我国是花生出口贸易大国，黄曲霉毒素超标是影响我国出口花生的主要问题[3]。现在已鉴定出二十多种黄曲霉毒素，其中黄曲霉毒素B1(AFB1)分布范围最广，并且毒性最强[4]，1993年AFB1被世界卫生组织癌症研究机构(IARC)归为IA类致癌物。目前世界上约有一百多个国家对食品中黄曲霉毒素提出了限量要求，我国规定花生和玉米中AFB1的最大限量为20 μg/kg[5]，欧盟所有成员国严格规定花生等食品中AFB1的含量不能大于2 μg/kg，所有黄曲霉毒素含量不能大于4 μg/kg[6]。因而，寻找能有效脱除花生等农产品中黄曲霉毒素方法对保障食品安全具有重要意义。

国内外去除AFB1的方法主要有辐照、热处理、吸附剂脱毒等物理法[7-8]，及强碱、强酸、氧化剂处理等化学法[9-10]，但这些理化方法不仅成本高、效率低，且部分方法还伴有毒性物质产生。微生物脱毒法成为近年来的研究热点，该方法主要是利用细菌、真菌等微生物及其代谢产物去除食品中污染的AFB1[11]，该脱毒法对原料无污染、具有高度专一性、同时避免毒素重新产生，因此是一种高效、安全的去毒方法。本研究通过以香豆素为唯一碳源的初筛和AFB1的复筛，从青岛莱西花生地土壤中筛选得到一株能高效降解AFB1的菌株，并对其降解AFB1的特性做了初步研究，对该菌生理生化和系统发育学特征进行了详细的分析，为深入研究其脱除AFB1的作用机理及应用于AFB1脱毒奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 样品和主要试剂

土壤样品采自山东省花生研究所试验基地(青岛莱西)。AFB1标品购自Fermentek公司，香豆素购自上海融禾医药科技发展有限公司，色谱级甲醇购自Merck公司，细菌基因组DNA提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购自天根公司，黄曲霉毒素免疫亲和柱购自华安麦科公司，Super GelRed荧光染色试剂染色购自US Everbright Inc，pMD19-T载体购自TAKARA公司。

1.2 培养基

初筛培养基为香豆素液体筛选培养基(g/L)：0.25g KH2PO4，0.25g MgSO4·7H2O，0.5g KNO3，0.5g(NH4)2SO4，0.005g CaCl2，0.003g FeCl3·6H2O，pH 7.0，121℃高压灭菌20 min后，加入除菌的香豆素，终溶液浓度为1 g/L。香豆素固体筛选培养基：在液体培养基的基础上加入20 g/L琼脂。LB液体培养基(g/L)：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，pH 7.0。LB固体培养基：LB液体培养基中加入20 g/L琼脂。发酵培养基(g/L)：10g蛋白胨，3g牛肉膏，10g NaCl，1g KH2PO4，1g葡萄糖，pH 7.0。

1.3 AFB1降解菌的分离筛选

1.3.1 初筛

土壤样品以10倍无菌水混匀稀释，稀释液按1/20接种量接种到初筛培养基，150 r/min 37℃培养10～15 d。菌液浑浊后涂布在香豆素固体筛选培养基上，置于37℃培养箱中培养。观察细菌生长情况，根据菌落形态、颜色等挑取单菌落，在LB固体培养基上多次划线纯化培养。纯化的菌株在LB液体培养基培养后，加入20%甘油，置于-20℃冰箱保存。

1.3.2 复筛

初筛菌株接种于发酵培养基，37℃培养48 h。避光条件下，980μL发酵菌液加入20μL 5mg/kg的AFB1标准品，使发酵液中AFB1终浓度100μg/kg，无菌发酵培养基为空白对照，37℃避光培养72 h。

1.4 AFB1检测

10000r/min离心10 min，上清液经0.22 μm滤膜过滤后过免疫亲和柱，先用10 mL超纯水洗两遍，最后用色谱级甲醇洗脱，收集洗脱液。采用HPLC检测溶液中AFB1的含量，HPLC检测条件为：Agilent1260高效液相色谱仪，C-18色谱柱(4.6 mm×15 cm×5 μm)，进样量为20 μL，流动相为甲醇∶水=1∶1(V/V)，流速0.8 mL/min，荧光检测器激发波长360 nm，发射波长440 nm。利用以下公式计算菌株对AFB1的降解率：

AFB1降解率(%)=

1.5 菌株的鉴定

通过以上筛选过程，挑选出一株降解AFB1效率最高的细菌，编号为H2。采用生理生化方法和16S rRNA基因序列分析确定该菌的分类地位。

1.5.1 细菌形态鉴定

接菌在LB固体培养基，37℃培养2d后观察菌落颜色、形态，进行革兰氏染色。

1.5.2 生理生化鉴定

使用法国梅里埃公司的API 20NE试剂盒分析H2的生理生化特征。

1.5.3 细菌16S rRNA基因序列分析

取新鲜培养的H2菌液，使用DNA提取试剂盒提取H2的基因组DNA。16S rRNA基因通用引物为27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3 '[12]。

1.5.4 PCR的反应体系

25μL体系：Taqbuffer 2.5μL，dNTPs 2μL，Taq聚合酶0.2μL，引物27F和1492R各1μL，H2菌基因组模板 1μL，ddH2O 17.3μL。

1.5.5 PCR扩增程序

94℃预变性10min；94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸100s，30个循环；72℃延伸10min。反应结束后，3μL PCR产物上样于1%琼脂糖凝胶(Super GelRed荧光染色试剂染色)，100V电压电泳30 min后经凝胶成像系统检测结果，得到清晰的目的条带后进行回收，连接到pMD19-T载体，转化到大肠杆菌中。将阳性克隆菌液送到上海生工生物有限公司测序。

1.5.6 序列的数据处理与分析

利用NCBI的Blast工具从GenBank数据库中搜索已知序列同源性较高序列。将目标序列与搜索到的同源序列经ClustalW分析后，再用MEGA6.1 软件的邻近法构建系统进化树。

1.6 菌株H2降解特性研究

10mL的菌株H2发酵液，4℃下10 000r/min离心10min，分离得到上清液和菌体。菌体用无菌蒸馏水洗涤、离心，重复3次后加入10 mL无菌蒸馏水制备成H2菌悬液。按上述方法制备10 mL菌悬液，然后在冰上超声破碎20 min后离心，收集的液体经0.22μm过滤制备H2的胞内液。将H2上清液、菌悬液、胞内液分别加入AFB1，在37℃孵育72 h后，检测各组分AFB1降解率。

2 结果与分析

2.1 菌株初筛和复筛

通过以香豆素为唯一碳源的初筛，获得4株菌株，复筛后发现这四株菌都能不同程度地降解AFB1，菌株H1、H2、H3和H4的降解率分别为50.6%、84.7%、61.1%和46.3%，其中菌株H2的降解率最高(图1)。

2.2 H2菌株的鉴定

形态及生理生化鉴定：菌株H2在LB培养基上为淡黄色的圆形菌落，菌落边缘整齐，显微镜下细菌形态为杆状，革兰氏染色呈阴性。生理生化试验结果表明，菌株H2的精氨酸双水解酶和尿素酶反应为阳性，β-葡萄糖苷酶、明胶蛋白酶、β-半乳糖苷酶反应为阴性；能有效吸收利用阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇、癸酸、己二酸、柠檬酸、苯乙酸等碳源(附表)。参照《伯杰细菌鉴定手册》和相关文献[13]表明，菌株H2为假单胞菌属。

附表 菌株H2的生理生化特征

16S rRNA基因PCR结果分析：菌株H2的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，扩增的DNA在1000～2000 bp之间有单一条带(图2)，并且条带清晰整齐，亮度好。经测序分析，扩增的16S rRNA基因的片段长度为1497 bp，与已经公布的序列比对分析，构建系统进化树。由图3可知，菌株H2与PseudomonasputidaNBRC 14164T属于同一分支，核苷酸同源性高达99.52%，由此可确定，菌株H2为恶臭假单胞菌，命名为PseudomonasputidaH2。

图1 各菌株降解AFB1的能力

图3 16S rRNA基因的系统发育树Fig. 3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences

图4 菌株H2各组分降解AFB1特性Fig. 4 Degradation of AFB1 in each component of strain H4

2.3 H2菌株降解特性

比较菌株H2的上清液、菌悬液、胞内液降解AFB1的能力，发现上清液的降解能力最强，达到84.7%，菌悬液和胞内液的降解能力相对较弱，分别为13.6%和7.8%(图4)。由此判断，菌株H2降解AFB1不是依赖细菌胞体的吸附作用，而是细菌代谢产生并分泌至胞外的活性物质主导的生物降解作用。

3 讨 论

由于香豆素是AFB1结构的主要组成部分，因此在初步筛选时选择香豆素作为唯一碳源，并且也减少了实验人员直接接触AFB1的机会，增加操作的安全性[14]。黄曲霉毒素比较稳定，而没有在自然界中无限积累，其中微生物降解起了重要作用。李俊霞等利用香豆素为唯一碳源从马来貘粪便中筛选到降解AFB1的嗜麦芽窄食单胞菌[15]。张盼等利用香豆素从纳豆中筛选出一株能降解AFB1的枯草芽孢杆菌Natto3[16]。花生是黄曲霉毒素污染的主要作物之一，本研究以香豆素为唯一碳源从种植花生的土壤中筛选出4株菌株，进一步使用AFB1筛选发现这四种菌都能不同程度地降解AFB1，其中菌株H2能降解84.7%的AFB1，该实验结果进一步表明利用香豆素进行黄曲霉毒素降解菌株的筛选是可行的。

研究发现有些微生物脱毒的机理是吸附作用，如有的乳酸菌体吸附毒素形成菌体—毒素复合物[17]，该复合物可以减少生物体对黄曲霉毒素的吸收和代谢作用，然而乳酸菌吸附毒素与释放是可逆的，在生物体内环境变化后可能会再次释放到机体中，这种吸附作用没有实现黄曲霉毒素去除的目的[18-19]。因而，生物降解能够将黄曲霉毒素进行不可逆的降解处理，相比生物吸附作用，具有更好的应用前景。Guan等发现嗜麦芽窄食单胞菌的胞外液能降解82.5%的AFB1[14]，Sangare等发现铜绿假单胞菌N17-1的胞外液能降解82.8%的AFB1[20]；Gao等发现枯草芽孢杆菌ANSB060上清液能降解81.5%的AFB1[21]；Petchkongkaew等分离的一株芽孢杆菌能降解74%的AFB1[22]。本研究分别分析了菌株H2的上清液、菌悬液、胞内液降解AFB1的能力，表明不是细菌菌体的吸附作用，发现细菌胞外的活性物质能高效降解84.7%的AFB1，相对已报道的一些降解菌株，菌株H2的AFB1降解率较高。

4 结 论

本研究从青岛莱西花生田土壤中分离到4株能降解AFB1的菌株，其中菌株H2的降解率最高，达84.7%。通过细菌形态、理化性状、16S rRNA基因序列比对分析，鉴定菌株H2为恶臭假单胞菌，命名为PseudomonasputidaH2。通过各组分脱毒活性的比较，发现菌株H2分泌到胞外的活性物质主导AFB1降解。本研究为今后深入研究该菌的降解机理及应用于AFB1脱毒奠定了基础。