花生栽培种γ-TMT基因的克隆和序列分析

刘 婷，唐月异，胡东青，王秀贞，吴 琪，孙全喜，王志伟，宋国生，徐建志，殷冬梅*，王传堂，*

(1. 河南农业大学农学院，河南 郑州 450002； 2.山东省花生研究所，山东 青岛 266100；3.青岛出入境检验检疫局，山东 青岛 266002)

花生是我国主要的经济作物，不仅是食用油脂和蛋白质的重要来源，而且含有丰富的不饱和脂肪酸、维生素及膳食纤维，具有降低低密度脂蛋白胆固醇等保健效果[1]。食物中的维生素E主要来源于植物油，花生油中就含有大量天然维生素E[2-3]。维生素E抗氧化，延缓衰老，可保护机体细胞免受自由基的毒害[4-5]。

生育酚是脂溶性抗氧化剂，和生育三烯酚类同属于维生素E家族，其中α-生育酚是天然维生素E的最主要成分[6]。生育酚的结构由一个苯并吡喃环、一个含异戊二烯的亲油链和若干甲基基团组成，而根据甲基基团在苯环上位置和数量的不同，有四种异构体(α-生育酚，β-生育酚，γ-生育酚，δ-生育酚)[7]。在清除自由基、淬灭单线态氧等抗氧化能力方面，各种生育酚的顺序是α>γ>δ>β。因此，α-生育酚的生物活性最高，β、γ、δ-生育酚的生物活性仅为α-生育酚的3%～50%[8]。

α-生育酚的高生物活性和常温下的较强抗氧化性[9]，使得提高α-生育酚含量成为重要的育种目标之一。而在光合生物中，生育酚在不同组织的组成情况很大程度上取决于γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)和2-甲基-6植基-苯醌甲基转移酶的活性，γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)是生育酚合成途径最后阶段的关键酶，它催化γ-生育酚甲基化成α-生育酚。因此可以说γ-TMT基因控制着α-生育酚含量的高低。本研究目的是克隆花生栽培种γ-TMT基因，为通过分子手段培育高α-生育酚花生品种创造条件。

1 材料与方法

1.1 试验材料

花生栽培品系CTWE。

1.2 基因编码区全长的获取

在花生数据库PeanutBase中，查找获取栽培种二倍体野生祖先种A.duranensis和A.ipaensis的γ-TMT编码区序列全长，其在花生数据库中的ID分别是Aradu.6UD07和Araip.FS9KX。

1.3 花生籽仁DNA提取

花生籽仁DNA提取采用SDS抽提法。用刀片切一薄片子叶，取10 μL枪头口大小子叶，放入1.5mL离心管中，加入0.2mL SDS提取液(1mol/L Tris-HCl，0.5mol/L EDTA，10%SDS)，用研磨棒研磨后55℃水浴20min，加入0.2mL苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，12000 r/min、15 min，提上清150 μL(尽量多提)转入新试管，加入等量异戊醇，12000 r/min离心2 min，回收沉淀，待风干后，加入TE 50 μL做模板，保存于-20℃冰箱备用。

1.4 引物设计

根据野生种A.duranensis和A.ipaensis的γ-TMT序列，利用Primer Premier 5.0软件分别设计引物，经筛选确定了最终引物(表1)。

表1 引物序列

1.5 PCR扩增

PCR反应体系(50 μL)：PrimesSTAR®GXL DNA Polymerase 1 μL，正反向引物各2 μL，模板2 μL，5×PA GXL Buffer 10 μL，2.5 mol/L dNTP 4 μL，加ddH2O补足体系。反应程序：94℃预变性1 min，98℃变性10 s，55℃退火15 s，68℃延伸3.5 min，共35个循环，结束反应。用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。目的条带切胶回收后进行连接转化。最后把挑取的阳性单克隆送至华大基因公司进行测序。

1.6 花生γ-TMT基因的生物信息学分析

利用DNAStar软件的EditSeq功能，分析蛋白分子量、酸性氨基酸、碱性氨基酸、疏水性氨基酸、极性氨基酸的含量和等电点等理化性质，利用Protein功能，预测蛋白质序列二级结构。利用GSDS(Gene structure display server)对基因的外显子/内含子结构分析，通过NCBI的BLASTP(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.html)功能分析基因的保守域。利用在线生物信息学软件ExPaSy的ProScale(http://web.expasy.org/protscale/)对该基因编码的蛋白进行亲/疏水性分析，利用signalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对该基因编码蛋白的信号肽进行预测，通过生物信息学软件PSORT Ⅱ(https://psort.hgc.jp/form2.html)对基因编码蛋白进行亚细胞定位预测，利用生物序列分析中心网站(Center for Biological Sequence Analysis ，网址 http://www.cbs.dtu.dk)的TMHMM-2.0软件对该基因编码蛋白进行跨膜域预测，利用CBS的 Protfun 2.2(http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)在线生物信息学软件对该基因编码的蛋白进行功能预测。同源基因在DNAMAN软件中进行ClustalW聚类分析。

2 结果与分析

2.1 花生γ-TMT基因编码区序列的克隆

以栽培品系CWTE籽仁DNA为模板，使用筛选出的γ-TMT引物，经PCR各扩增出一条3.4 kb左右的片段(图1)。根据花生数据库所获二倍体野生种A.duranensis和A.ipaensis的γ-TMT编码区全长为3170 bp和3124 bp，本研究得到的Ahγ-TMT1和Ahγ-TMT2编码区全长分别为3111 bp和3124 bp，都含有6个外显子和5个内含子(图2)，开放阅读框(ORF)长均为1059 bp，编码352个氨基酸(图3，图4)。该两条序列已经成功提交Genbank数据库，Genbank登录号分别为MG637045和MG637046。

图1 PCR产物电泳图 Fig.1 Electrophoresis of PCR products 注： Ad表示Ahγ-TMT1，Ap表示Ahγ-TMT2。 Note: The "Ad" indicate "Ahγ-TMT1", the "Ap" indicate "Ahγ-TMT2".

图2 基因结构比较 Fig.2 The comparison of gene structures 注：白色方框代表外显子，细线代表内含子， 0代表内含子相位。 Note: White-box indicates exon, line indicates intron, 0's indicates intron phases.

图3 Ahγ-TMT1基因的核苷酸及氨基酸序列 Fig.3 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of Ahγ-TMT1

图4 Ahγ-TMT2基因的核苷酸及氨基酸序列 Fig.4 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of Ahγ-TMT2

2.2 花生γ-TMT的生物信息学分析

2.2.1 花生γ-TMT编码蛋白的氨基酸序列分析

对Ahγ-TMT1和Ahγ-TMT2基因编码的蛋白质进行物理化学性质分析，结果显示：Ahγ-TMT1蛋白的理论分子量为 39.08 kD，理论等电点6.72，脂溶指数88.78，总平均亲水系数为-0.113。Ahγ-TMT2蛋白的理论分子量39.15 kD，理论等电点6.47，脂溶指数90.17，总平均亲水系数-0.104。

NCBIBLASTP分析结果表明，Ahγ-TMT1和Ahγ-TMT2基因分别有1个保守域，且都位于第65～352位氨基酸之间，该区域是生育酚甲基转移酶(γ-TMT)的特征序列(图5，图6)。

图5 Ahγ-TMT1基因编码的蛋白保守域分析 Fig. 5 Analysis of conserved domain in Ahγ-TMT1 protein

图6 Ahγ-TMT2基因编码的蛋白保守域分析 Fig. 6 Analysis of conserved domain in Ahγ-TMT2 protein

经DNAStar软件Protein功能的Garnier-Robson 法分析预测蛋白质二级结构，显示Ahγ-TMT1蛋白中α 螺旋占65.9%，β折叠占5.11%，转角构象15.1%，无规卷曲占 13.9%；Ahγ-TMT2蛋白中α螺旋占64.5%，β折叠占4.83%，转角构象15.6%，无规卷曲占15.1%。

2.2.2 基因编码蛋白的信号肽、亚细胞定位和跨膜域预测

预测结果表明，上述基因编码蛋白没有信号肽和跨膜域，不属于分泌蛋白，亚细胞定位在线粒体上的蛋白占73.9%，定位在细胞质的蛋白占13.0%，其他均不超过5.0%。

图7 不同物种γ-TMT氨基酸序列比对 Fig. 7 Multiple sequence alignments of γ-TMTs from different species

物种 Species登录号 Accession No.相似性 Similarity/% Ahγ-TMT1MG637045100.00 Ahγ-TMT2MG63704697.16花生野生种 A.duranensisXM_016109238100.00花生野生种 A.ipaensisXM_01634679897.16水稻 Oryza sativa XP_01562308660.88小麦 Triticumaestivum DQ13926661.75玉米 Zea maysAJ63470660.00大豆 Glycine maxAY96012673.09油菜 Brassica napusDQ50801962.15芥菜型油菜 Brassica junceaABI2343361.58甘蓝型油菜 Brassica oleraceaAF38124861.86拟南芥 Arabidopsis thaliana NM_105171 64.12马铃薯 SolanumtuberosumABE4179564.23向日葵 Helianthus annuusABB5280065.91棉花 GossypiumhirsutumABE4179866.19日本百脉根 Lotus japonicusAAY5245967.13番茄 Solanumlycopersicum ABE41794 64.74

图8 不同物种γ-TMT氨基酸序列的系统进化树 Fig.8 Phylogenetic tree of different species based on γ-TMT sequences

2.3 同源基因氨基酸序列比对

利用DNAMAN软件将Ahγ-TMT1和Ahγ-TMT2氨基酸序列与花生栽培种的两个野生祖先种、水稻、小麦、玉米、大豆、油菜、芥菜型油菜、甘蓝型油菜、拟南芥等13种不同作物γ-TMT氨基酸序列进行比对，结果显示Ahγ-TMT1氨基酸序列和野生种A.duranensis氨基酸序列完全一致，Ahγ-TMT2氨基酸序列和野生种A.ipaensis氨基酸序列完全一致；另与不同作物相似性比较结果显示，花生与大豆相似性最高，为73.09%，与其他作物的相似性为60.00%～67.13%(表2，图7)。基于γ-TMT氨基酸序列构建的系统进化树表明，花生和大豆亲缘关系最近，与同为豆科的日本百脉根亲缘关系稍远，其次马铃薯和番茄同为茄科，水稻、小麦和玉米属禾本科，油菜、芥菜型油菜、甘蓝型油菜和拟南芥属十字花科，向日葵属菊科，棉花属锦葵科，它们按照亲缘关系归成一类(图8)。

3 结论与讨论

维生素E的含量和组成与维生素E的活性及抗氧化性能密切相关，提高维生素E含量和优化各组分比例能有效提高其活性及抗氧化作用。维生素E是动物必需却不能自主合成，必须从食物中摄取的维生素。维生素E可以在所有的高等植物中合成，有关提高维生素E含量，改良维生素E组分的研究已较为深入[10]。γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)是第一个在拟南芥中分离得到的参与维生素E合成的关键酶，它是维生素E合成途径中最后一个酶。拟南芥γ-生育酚甲基转移酶可以改变种子中维生素E的组分，过量表达使种子中的γ-生育酚大量转化为α-生育酚[11-12]。Shintani和DellaPenna在拟南芥中过量表达γ-生育酚甲基转移酶使α-生育酚的含量提高了80倍[13]。在水稻、紫苏、大豆中分别过量表达γ-生育酚甲基转移酶，α-生育酚的含量都得到了显著提高[14-16]。Jin[17]等将拟南芥AtTM7基因转入烟草中，提高了转基因烟草种子中α-生育酚的含量，然而并未改变转基因烟草叶片中维生素E总的含量。

关于花生γ-生育酚甲基转移酶基因相关研究，李栓柱等从花生栽培种中克隆得到的γ-TMT基因，认为是B基因组基因序列，不含内含子，编码区长1059 bp，编码352个氨基酸。本研究成功从花生栽培种A、B两个基因组中克隆到2个γ-TMT基因完整编码区，开放阅读框(ORF)长和编码氨基酸数量与李栓柱[18]等的报道相同，但不同的是克隆到的2个γ-TMT基因均具有内含子，不排除系栽培种基因型间的差异所致。本研究为下一步花生维生素E含量分子育种提供了参考。