连作花生根腐病镰刀菌分离与对峙培养

陈为京，郭 峰，陈建爱，万书波*

(1. 山东省作物遗传改良与生态生理重点实验室，山东 济南 250100；2.山东省农业科学院原子能农业应用研究所/农产品研究所/农业部新食品资源加工重点实验室，山东 济南 250100)

连作障碍成为花生产量低且不稳定的重要因素之一，许多学者认为土传病虫害是花生连作障碍产生的重要因素，也是连作障碍的主要因子[1]，花生生长后期根腐病是花生连作减产的主要原因或协同原因或诱因[2]，而花生根腐病以镰刀菌(Fusariumspp)为主。连作使土壤环境更利于以花生为寄主的镰刀菌的存活与繁殖，使土壤微生物区系变化明显失去生态平衡[3]，连作花生根系分泌物促进镰刀菌生长[4]，造成镰刀菌在土壤中的积累，发病率随连作年限成倍增加，生产者靠加大药剂用量和频繁用药来控制，使镰刀菌抗药性增强，造成环境和农产品的污染。

生物防治植物土传病害是目前国内外学者的研究热点[5]，木霉(Trichodermaspp.)是国际上公认的防治土传病害的重要生防因子之一。研究表明，木霉对作物土传病原菌具有竞争作用、重寄生作用、抑菌作用[6-8]，可诱导作物产生系统和局部抗病性，促进作物生长[9]。

本文通过分离花生根腐病病原真菌镰刀菌以及比较黄绿木霉T1010(T.aureviride1010)和镰刀菌在单独和对峙培养中生长速度的差异，试图阐明黄绿木霉T1010抑制花生根腐病镰刀菌机制。旨在探讨黄绿木霉T1010对花生根腐病镰刀菌作用方式，明确黄绿木霉T1010对花生根腐病的抑菌作用，为防治花生根腐病、提高花生品质和产量提供理论和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 根腐病标样、生防菌

花生根腐病标样于2015年8月采自山东花生种植老区，共计花生根腐病病株36份。黄绿木霉菌株T1010为黄绿木霉T32(由山东省农科院原子能农业应用研究所微生物实验室分离)利用60Co-γ射线和紫外线复合诱变选育的优良菌株[10]。

1.1.2 培养基

分离培养基为马丁(Martin)培养基：蛋白胨5g，葡萄糖10g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，琼脂20g，1/30000孟加拉红水溶液100mL，链霉素30 g/mL，琼脂20g，加水至1000mL，pH 7.0～7.2；大量培养基为马铃薯培养基(PDA)：马铃薯(去皮、煮30min，8层纱布过滤)200g浸液，葡萄糖20g，琼脂20g，加水至1000mL，pH 5.4～6.0。

1.2 方法

1.2.1 根腐病病原菌菌株分离与纯化

采用常规分离方法，将花生病根剪成3～5mm，分别用0.1%升汞、10%次氯酸钠、70%乙醇表面消毒，用无菌水冲洗沥干水分后接入马丁培养基，26℃培养5～7d后单菌落纯化转接PDA，结合微观技术再单孢分离纯化培养，4℃储存备用。

1.2.2 镰刀菌菌株的形态学鉴定

将待鉴定镰刀菌菌株接种于PDA平板上，置26℃下培养5～14d，观察菌落形态，同时挑取菌丝及分生孢子制片，观察小型分生孢子、大型分生孢子、厚垣孢子大小和形态，按魏景超的真菌鉴定手册的镰刀菌种群分类系统及Booth的镰刀菌属进行菌株鉴定[11-12]。

1.2.3 镰刀菌菌株的分子学鉴定

将待测镰刀菌菌株液体培养2～4d，称取50mg菌丝于样品研磨仪，利用PCR扩增技术，采用引物为ITS1、ITS4，送交山东省农业科学院生物技术研究中心进行测序，检测的的序列提交Genbank进行BLAST搜索和同源性比对分析，选择同源性高于99%的种进行菌株鉴定。

1.2.4 对峙培养试验

黄绿木霉T1010和镰刀菌系列F菌株分别在PDA平板上活化，26℃培养3 d和5 d。活化好的菌株T1010和系列镰刀菌F的菌片(Φ5 mm)分别接种于直径90 mm的PDA平板中，菌片边缘距离皿的边缘20 mm，两菌片边缘相距40 mm，同时分别单独接种作对照。重复4次，26℃培养10 d。定时观察、记录菌落半径，计算菌株T1010对各个镰刀菌F菌株的抑菌率和覆盖率。为了评价黄绿木霉T1010对镰刀菌的拮抗程度，采用1～5级分级标准[13]：1级(木霉菌完全长过病菌，并覆盖整个培养皿)；2级(木霉菌长过全皿的2/3以上)；3级(木霉菌占1/2～2/3)；4级(病菌占全皿2/3以上)；5级(病菌长过木霉菌，并覆盖全皿)。

1.2.5 作物田间发病分级标准(表1)

1.3 数据分析

利用SAS统计软件(V8.2)中REG、ANOVA生长曲线Y=k/(1+aebx)、记录菌落半径，计算T1010和镰刀菌的生长规律，比较菌株T1010对镰刀菌F菌株抑菌作用和抑菌效果。

2 结果与分析

2.1 花生根腐病病菌镰刀菌分离

2015年山东花生种植区花生根腐病发病不很严重，但也引起以下危害，济宁地区花生播种后出苗前染病，侵染刚萌发的种子，造成烂种不出苗，随后又出现花生幼苗受害，主根变褐，植株枯萎，造成缺苗；2015年8月花生饱果期，各地区发病程度不同，临沂地区花生成株受害，发病严重地块，花生大面积萎蔫，部分花生整株枯死(表2)，形成枯萎或萎蔫病害圈和片，主根根茎上出现凹陷长条形褐色病斑，根部腐烂易剥落，无侧根或很少，地上植株矮小，叶片黄，开花结果少，且多为秕果或病果。在发病严重区取发病株，进行室内病菌分离培养，病株携带镰刀菌的频率不同，有的地区分离出一种镰刀菌，有的地区分离出多种镰刀菌，其中临沂花生根腐病发病严重地块有一株花生病株分离获得3种镰刀菌(尖镰刀菌、茄腐皮镰刀菌、木贼镰刀菌)、4株镰刀菌菌株(F1、F2、F4、F6) ，以此4株镰刀菌菌株为模式进行试验。

表1 作物田间发病分级标准

表2 2015年花生种植老区花生根腐病现状

2.2 花生根腐病镰刀菌菌株形态学鉴定

2.2.1 菌株F1的形态特征

PDA上菌丝体白色，高而疏松，气生菌丝不致密、不舒展，后变为毡状，菌落背面绚丽紫色(附图 a，b)，小型分生孢子经常发生，生长茂盛，数量多，大型分生孢子生长稀少，数量少，厚垣孢子数量极少。依据真菌鉴定手册及Booth的镰刀菌属初步鉴定该菌为尖镰刀菌(Fusariumoxysporum)。

2.2.2 菌株F2的形态特征

PDA上菌丝体浅土黄色，气生菌丝致密，产生液体，菌落背面土黄色，菌丝生长均匀，菌落规整(附图 c，d)，小型孢子不经常发生，大型分生孢子团生，大型分生孢子多，与厚垣孢子不混生，厚垣孢子多。依据真菌鉴定手册及Booth的镰刀菌属初步鉴定该菌为茄腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)。

2.2.3 菌株F4的形态特征

PDA上菌丝体白色，气生菌丝短、致密，淡黄色，菌落背面米黄色、夹杂蓝色深蓝色性状(附图 e，f)，子座大，菌核组织大，培养7～14 d后，厚垣孢子大量形成，大、小型分生孢子混生，小型分生孢子少，大型分生孢子多。依据真菌鉴定手册及Booth的镰刀菌属初步鉴定该菌为马氏茄腐皮镰刀菌丙型(花生基腐镰刀菌)(Fusariumsolanivar.martii)。

2.2.4 菌株F6的形态特征

PDA上菌丝丰茂、白色的气生菌丝逐渐变为橄榄黄色，菌丝高而密，生长快，菌落棉絮状，菌落背面桃红色以后变为浅黄褐色(附图 g，h)，小型分生孢子量少，大型分生孢子镰刀状，厚垣孢子间生。依据真菌鉴定手册及Booth的镰刀菌属初步鉴定该菌为木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)。

附图 镰刀菌菌株菌落形态特征Fig. Colony morphological characters of Fusarium strains 注： a：F1菌落正面，Face of F1 colony； b：F1菌落背面；Back of F1 colony； c：F2菌落正面，Face of F2 colony； d：F2菌落背面；Back of F1 colony； e：F4菌落正面，Face of F4 colony； f：F4菌落背面；Back of F4 colony； g：F6菌落正面，Face of F6 colony； h：F6菌落背面 Back of F6 colony。

2.3 花生根腐病镰刀菌菌株分子学鉴定

传统的镰刀菌鉴定方法都是基于形态特征，主要是通过菌落大小、小型分生孢子、大型分生孢子、厚垣孢子及菌落色素的比较，但由于镰刀菌形态特征的可变性比较强，表现不稳定，随生态环境变化大，而ITS区不加入成熟核糖体，ITS片段在进化过程中承受的自然选择压力非常小，表现了极为广泛的序列多态性，种内相对一致，种间序列间差异比较明显，ITS序列分析比对能实质性地反映出属间、种间以及菌株间的碱基对差异，ITS1引物为TCCGTAGGTGAACCTGCGC，ITS4引物为TCCTCCGCTTATTGATATGC，通过测序及比对分析，F1为尖镰刀菌(Fusariumoxysporum)，F2、F4为茄腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)，F6为木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)。

2.4花生根腐病镰刀菌与黄绿木霉T1010对峙培养

2.4.1 镰刀菌和黄绿木霉T1010单独培养

镰刀菌菌株F1、F2、F4、F6在PDA平板上活化，分别单独培养10 d，菌丝生长旺盛，菌苔厚薄不一，菌落颜色不一，菌落整齐、规则，均符合S生长曲线Y=k/(1+aebx)(表3，Pr均小于0.01)，镰刀菌菌株F6生长和速度快，培养10 d满皿(Φ 90mm)，F2生长最慢，菌落占四分之三培养皿，黄绿木霉菌株T1010单独培养也符合S生长曲线，培养4 d满皿并产生大量分生孢子生长速度比镰刀菌菌株大大提高。

2.4.2 镰刀菌与黄绿木霉T1010对峙培养

镰刀菌与黄绿木霉T1010接种于PDA平板上，对峙培养，菌株T1010生长正常，生长曲线与单独培养生长曲线基本吻合，4株镰刀菌与黄绿木霉T1010对峙培养，黄绿木霉T1010生长与单独培养比较显著性检验无差异(Pr=0.71，Pr=0.59，Pr=0.70，Pr=0.72)；镰刀菌开始生长正常，培养3d后与菌株T1010相遇后，镰刀菌菌丝生长受限，不符合一般S生长曲线，培养10d后，F1、F2、F4、F6生长极限值在17.5mm、18.0mm、15.8mm、20.8mm以下，与单独培养比较差异显著(Pr<0.0001，Pr=0.0016，Pr=0.0008，Pr=0.0014) (表4)。

表3 镰刀菌和黄绿木霉T1010菌落生长比较

注：R(4, 2)0.01=0.917 (T1010生长曲线)，R(10, 2)0.01=0.708 (镰刀菌菌株生长曲线)。

Note:R(4, 2)0.01=0.917 (Growth curve of T1010),R(10, 2)0.01=0.708 (Growth curve ofFusarium).

表4 镰刀菌不同条件生长比较

2.4.3 黄绿木霉T1010对镰刀菌的拮抗作用

黄绿木霉T1010和镰刀菌对峙培养3 d，对峙界面处，T1010生长旺盛，镰刀菌菌落生长受限，T1010对镰刀菌F1、F2、F4、F6的抑菌率分别为88.5%、71.4%、82.4%、71.2%；T1010在镰刀菌菌落上继续生长，10d后，T1010覆盖镰刀菌F1、F2、F4、F6部分菌落并产生大量分生孢子，覆盖率分别为32.4%、5.4%、41.2%、36.3%。T1010对镰刀菌F1、F2、F4、F6拮抗级别分别达到2级，拮抗作用强。T1010与病菌交界处，T1010菌丝生长于F1、F2、F4、F6病菌菌丝上产生大量分生孢子，进一步观察，T1010对4株镰刀菌菌株作用不同，F1菌丝细胞壁降解，小型分生孢子产生被抑制，菌核被破坏；F2菌丝断裂，大、小型分生孢子被木霉分生孢子包围；F4病菌菌丝被T1010分生孢子包围，大型分生孢子和厚垣孢子很少形成，菌丝间有很多木霉分生孢子；F6菌丝内容物收缩、菌丝断裂，菌索松散，子座上有T1010分生孢子，少量厚垣孢子，少量大型孢子。

3 讨论及结论

花生根腐病镰刀菌在土壤中生存和繁殖，镰刀菌从花生苗期开始侵染花生，花生根腐病调查发现有的地块到花生饱果期才表现花生感病，并且花生出现大面积萎蔫、枯死，镰刀菌感染花生寄生时间长，具有很大隐蔽性，后期花生根腐病的发生侵染花生荚果严重，导致花生荚果品质下降，甚至籽粒腐烂产生有毒物质，污染食物[12]。本试验分离镰刀菌发现侵染花生的镰刀菌种类多，多种镰刀菌共同致病，根腐病菌具有多样性、复杂性、持久性、多变性。

本研究表明，镰刀菌形态多样，随环境变化快，侵染致病性强，F1小型孢子数量大，花生苗期危害大，F2大型孢子多，团生，防治难度大，F4厚垣孢子多，抵抗能力强，茄腐皮镰刀菌是花生生长后期根腐病的主要致病菌。生物统计进一步证明对峙培养T1010的生长速度大于镰刀菌，4株镰刀菌的生长均受黄绿木霉T1010抑制。木霉对植物病原真菌的拮抗作用包含多种机制，一般认为有竞争作用[6]，产生抗菌物质及重寄生作用[7]。本实验中，黄绿木霉T1010生长速度快，从营养和空间竞争阻止了镰刀菌的生长，通过黄绿木霉T1010覆盖镰刀菌菌丝，表观现象证明黄绿木霉T1010能溶解镰刀菌菌丝，具有溶菌作用，显微观察，T1010限制了镰刀菌各种孢子的形成，阻止菌丝的发展，下一步需要通过生化实验分析论证。

另外发现镰刀菌在刚刚接触到黄绿木霉T1010时，病菌生长就受到限制，说明还有其他机制[8, 14-17]，同时黄绿木霉T1010和镰刀菌重叠时菌丝颜色发生变化，亦说明还有其他作用机制，镰刀菌受黄绿木霉T1010作用的更多机制还有待于进一步研究[17-18]。