芽孢杆菌（Bacillus spp.）防治豇豆根腐病效果

胡洪涛 ，朱志刚 ，李金泉 ，曹春霞 ，邱正明 ，姚经武 ，陈伟 ，祝花 ，王孝琴

（1.湖北省生物农药工程研究中心，武汉，430064；2.湖北省农业科学院经济作物研究所；3.武汉市农业技术推广中心）

豇豆根腐病为豇豆苗期重要土传性病害，在全国豇豆主产区普遍发生，严重时，死亡率高达70%以上。研究认为，武汉地区的豇豆根腐病的病原为茄腐皮镰刀菌（Fusarium solaniSchl.）[1]，而四川学者报道F.commune也可引起豇豆根腐病[2]，但不排除有不同镰刀菌侵染的可能[3]。一般认为，镰刀菌从根部或者茎基部侵染，导致表皮腐烂、维管束堵塞，植株萎焉死亡。该菌可长期在土壤中营腐生生活，可随雨水、农事操作等，进行远距离传播，而排水不畅、低洼积水的田块，发病较为严重。根腐病的防治，生产上主要采用化学药剂，如噁霉灵、甲霜灵等，进行灌根，但由于农户育苗时，常常采用田土，导致种苗带菌，移栽后，再进行药剂防治效果差，而且化学药剂灌根的浓度和用量，都要显著超过叶面喷雾。因此，研究新型的生物农药，替代化学药剂，减少化学农药用量，是化肥和农药减施的攻关任务顺利完成的重要保障。

本研究通过生长抑制法，发现芽孢杆菌（Bacillusspp.）对豇豆根腐菌（Fusariumspp.）具有较好的抑制作用，同时，采用拌种和灌根的方法，能够有效控制豇豆根腐病的发生，为研发控制豇豆根腐病的新型生物农药奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验田概况

试验于2016年4～6月，在湖北省农业科学院经济作物研究所南湖试验站进行，试验田为多年豇豆连作田，根腐发病率高达75%以上。土壤pH值5.35，N、P、K 含量偏低。

1.2 豇豆根腐病菌

豇豆根腐病菌（Fusariumspp.）分离于湖北省农业科学院经济作物研究所南湖试验站豇豆根腐病病株，保存于湖北省生物农药工程研究中心。豇豆根腐病菌采用PA液体培养基培养5～7 d后，采用无菌纱布将孢子过滤出来，调整孢子悬浮液浓度至1×106个孢子/mL，备用。

1.3 芽孢杆菌制备

芽孢杆菌（Bacillusspp.）为湖北省生物农药工程研究中心分离和保存。超低温甘油保存的菌株，首先在LB固体培养基上活化，挑取单菌落在NA液体培养基发酵24 h，经镜检无污染后，作为种子在50 L发酵罐中进行大量发酵48～72 h，发酵完成后，调整菌的浓度至1×108CFU/mL，于4℃保藏，备用。

1.4 芽孢杆菌活性评价

采用对峙培养法，评价芽孢杆菌对豇豆根腐菌的生长抑制活性。方法简述如下：先将豇豆根腐菌在PDA培养基培养2～3 d后，用无菌的打孔器，将靠近菌落边缘的菌丝打成菌丝块，接种于PDA培养基平板中心，并将芽孢杆菌接种于距根腐菌3 cm左右的地方，置于28℃恒温培养箱中培养3～5 d后，检测结果。

将芽孢杆菌发酵液，加入等体积的乙酸乙酯，放置于摇床（150 r/min，30℃）振荡 1.5 h 后，静置 1～2 h，酯相采用旋转蒸发仪进行旋蒸，残留物经称重后，用甲醇溶解，按照倍比稀释法，采用纸碟法进行生物测定，根据抑菌圈的大小计算抑制中浓度（EC50）。

将PDA培养基固体加热融化，冷却至50℃左右，按每250 mL培养基，加入1 mL孢子悬浮液，混匀后，倒入培养皿，待培养基凝固。

取20 μL芽孢杆菌发酵液提取物，加入消毒后的滤纸碟片，待干燥后，放入含豇豆根腐菌平板，25℃培养 3～5 d，检查抑菌结果。

1.5 芽孢杆菌拌种防治豇豆根腐病效果评价

芽孢杆菌发酵液，分别按照药种比25 mL∶1 kg、50 mL∶1 kg、100 mL∶1 kg 进行拌种， 对照药剂为30%噁霉灵水剂（市售），按照药种比4 mL∶1 kg拌种。加入药剂，充分搅拌均匀、阴干后，播入穴盘。并用清水拌种，作为空白对照（CKT）。 播种后24 h，将根腐菌孢子灌入穴盘，25 mL/穴。穴盘置于25℃人工温室内，12 h光照，12 h黑暗。

1.6 芽孢杆菌灌根防治豇豆根腐病田间试验

芽孢杆菌采用3个浓度处理，分别稀释50倍，100倍和200倍，对照药剂30%噁霉灵水剂稀释1 000倍，分别在移栽时、移栽后10 d和20 d，按250 mL/株进行灌根。每处理100株，重复3次，另设清水对照（CKD）。

1.7 结果调查与分析

于豇豆播种7 d后，检测豇豆发芽率。播种后30 d，观察和记录豇豆发病情况。大田试验，在最后一次施药后20 d，检查根腐病发病率、株高和根长等指标。数据输入Microsoft Excel进行处理，采用SPSS 19.0进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 芽孢杆菌发酵液对豇豆根腐病抑菌效果

平板对峙试验结果显示（图1），芽孢杆菌对豇豆根腐病菌的生长具有较好的抑制作用，其发酵产物对豇豆根腐菌的EC50为24.4 mg/L，说明该菌代谢产物中具有较好的抗菌物质。

2.2 芽孢杆菌拌种防治豇豆根腐病效果

图1 芽孢杆菌对豇豆根腐菌的平板抑制效果

表1 不同药剂拌种处理对豇豆发芽率和对根腐病的影响

表2 不同药剂灌根对豇豆根腐病田间防治效果

采用3种不同浓度的芽孢杆菌拌种 （表1），豇豆发芽率分别为96.5%、96.6%和93.3%，以药种比50 mL∶1 kg的发芽率为最高，均显著高于对照发芽率（83.2%），其中T1和T2处理的发芽率略高于对照30%噁霉灵水剂拌种（T4），而T3处理略低于噁霉灵拌种（T4），但在统计学上均无显著性差异。

由表 1 可知，T1、T2、T3处理对豇豆根腐病的防效分别为 76.8%、77.8%、89.1%， 其中 T1、T2处理防效显著性低于30%噁霉灵水剂（P＜0.05），而T3处理与噁霉灵处理无显著性差异。

2.3 芽孢杆菌灌根防治豇豆根腐病田间试验效果

由表 2 可知，D1、D2、D3处理豇豆根腐病发病率分别为19.3%、34.3%、47.3%，显著低于对照发病率（P＜0.05），同 30%噁霉灵水剂（D4，14.7%）比较，D1处理防效与其无显著差异，而D2和D3处理发病率显著高于噁霉灵处理。

芽孢杆菌灌根处理（D1、D2、D3）对根腐病的田间防效分别为 74.9%、55.5%、39.1%，D1处理防效（74.9%）与 30%噁霉灵处理（D4，81.4%）无显著差异（P＜0.05），但 D2和 D3处理显著低于噁霉灵处理。

3 结论与讨论

豇豆是湖北省乃至全国的主栽蔬菜品种之一，而豇豆根腐病在豇豆主产区普遍发生，由于豇豆生长季为4～6月，正逢长江流域梅雨季节，豇豆根腐病发生加重。豇豆根腐病的防治，多采用药剂灌根处理，然而，由于豇豆根腐菌的初侵染很多时候发生在苗床，移栽到大田时，即使用药防治，效果也不理想。因此，筛选有效的种衣剂或者拌种剂，从源头控制根腐病的发生，才能更好地防治根腐病。本研究筛选出的芽孢杆菌拌种处理，对豇豆根腐菌生长具有较好的抑制效果，既能较好地促进豇豆种子萌发，也能预防根腐病的发生。同时，田间灌根处理，能较好地防治豇豆根腐病的发生，其高浓度处理的防效与噁霉灵防效无显著性差异，但低浓度防效较差。因此，采用芽孢杆菌进行豇豆根腐病防治时，应提高使用浓度。