玉米邻甲基转移酶基因bx12-ZaC546的克隆及其生物信息学分析

史娟娟， 冯 贺, 刘恩卓, 李 鹏, 郑大浩

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

在自然界，危害玉米的害虫种类超过90种[1]。自然农业生态系统中，玉米植株从根到雄穗，受到根虫、叶咀嚼虫、茎秆蛀虫、潜叶虫、韧皮部蛀虫等众多害虫的侵害[2-3]。自然界多种草食动物群落与抗虫性变异和许多植株防御性状的表达同时发生，而且取食昆虫的地理分布表现出与特定的防御表现存在共变异的现象[4]。

植物对昆虫取食的抗性广义上定义为生抗性、排趋性或忍耐性。在大多数抗虫植株，其生抗性与排驱性或忍耐性协同(共同)发生[3]。玉米抗虫性来自化学的(如，次生代谢物)或形态学的(如，植物组织组成或结构方面的变化)防御机制。到目前为止，已知的玉米对昆虫取食的防御包括蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶、核糖体失活蛋白、玉米可凝性球蛋白，以及其他次生代谢产物介导的防御；其中，苯并噁嗪赋予了对刺吸式蚜虫、咀嚼式昆虫以及其他害虫、病菌的抗性[5-6]。体内和体外试验阐明苯并噁嗪赋予植物对范围很广的病原菌和草食动物的防御功能[7-16]。苯并噁嗪是一类防御性次生代谢物，在苗期趋最高，并随着植株的成熟而降低；其中，“的布”(DIBOA)、丁布(DIMBOA)和4-甲氧基丁布(HDMBOA)与玉米的抗虫性关系极为密切。丁布和4-甲氧基丁布因昆虫取食而转化为对昆虫剧毒的门布(MBOA)；相对而言，4-甲氧基丁布转化为门布的速度比丁布更快。然而，前人的研究表明，丁布和4-甲氧基丁布在玉米植株体内并非以游离的形式存在，而是以丁布葡萄糖苷(DIMBOA-Glc)和4-甲氧基丁布葡萄糖苷(HDMBOA-Glc)形式存在，而HDMBOA-Glc是在邻甲基转移酶的作用下是由DIMBOA-Glc酶促合成而来。2013年，Meihls等人已阐明在玉米中邻甲基转移酶是由bx12(又名bx10c)基因编码；但该基因的表达与调控机理如何还不清楚[3]。

过去玉米抗虫性的研究主要是集中在咀嚼性草食动物(如螟虫)上，而对刺吸式昆虫的抗性分子机制方面的研究很少。尤其是，同为刺吸式害虫的玉米叶螨，玉米对叶螨的抗性机制是否与抗蚜机制相关联，还不清楚。本研究以抗蚜、中抗螨玉米自交系ZaC546为材料，采用电子克隆技术，从玉米中分离和克隆邻甲基转移酶基因bx12，并采用生物信息学分析方法对所分离的目的基因生物信息进行分析；为进一步深入了解邻甲基转移酶基因在玉米对刺吸式害虫的抗性方面的作用和该基因的表达与调控机制奠定分子基础。

1 材料与方法

1.1 材料

用于分离和克隆目的基因所用的实验材料为玉米自交系ZaC546。用于克隆目的基因的载体为T/A克隆载体pMD-19T；所用细菌为感受态大肠杆菌(E.coli)菌株DH5α。PCR所用的试剂为Go Taq Green mix PCR试剂盒，其他试剂包括限制性内切酶BamH I和Xho I、连接酶T4 DNA Ligase、质粒(载体)提取和纯化所用试剂盒E.2.N.A.plasmid Miniprep Kit、PCR产物回收所用试剂盒E.2.N.A.Gel Extraction Kit、DL2 000 DNA marker、DL15 000 DNA maker、6×Loading buffer、10×Loading buffer、X-Gal、IPTG、酵母浸粉、胰蛋白胨、BIOWEST琼脂糖、CaCl2、甘油、氨苄青霉素、卡那霉素以及酶切缓冲液、10 × T4 DNA Ligase Buffer等。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物设计

1.2.2 PCR扩增的条件

由于引物的Tm温度分别为ZM3325(F)：Tm=51.9 ℃，ZM3325(R)：Tm=57.7 ℃，故采用梯度PCR方法摸索最佳扩增温度；PCR反应条件中，退火温度在48～62 ℃范围内设置8个梯度，即：48、49、50.7、53.4、56.5、59.1、60.9和62 ℃。

1.2.3 PCR产物的回收、与pMD19-T的连接

按梯度PCR摸索出的最佳退火温度进行PCR扩增并回收足够的PCR产物。经过琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上切取目标条带，然后用DNA凝胶回收试剂盒操作回收PCR产物，吸取回收PCR产物4 μL在琼脂糖凝胶上电泳检测产物的质量，确认符合预期结果后进行下一步的连接，将目标DNA(PCR产物)连接到T/A-克隆载体pMD19-T上，构建重组质粒pMD19T-Zm3325。

连接反应结束后，用重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α中。将转化后的大肠杆菌DH5α混合液涂布于含Amp、X-Gal和IPTG(Amp、IPTG和X-Gal与LB培养基的比例分别为1∶1 000、1∶1 000和1∶500)的选择性LB培养基上，然后将其放入37 ℃培养箱中培养10～12 h。

1.2.4 摇菌与测序

酶切验证正确后，含有正确重组质粒的大肠杆菌扩增繁殖，将扩繁的菌液送交上海立菲生物技术有限公司进行测序。

柳红无父无母，只有爷爷奶奶——也不是她的亲爷爷亲奶奶，但比亲爷爷亲奶奶还要亲。柳红的爷爷奶奶膝下无人，奶奶信佛，别人初一十五去虎山头烧香，她三天两头去。有一天早晨她刚在观音菩萨面前烧完香，就听到婴儿的哭声。奶奶就把襁褓里的柳红捡回了家。当时爷爷奶奶已六十多了，对这个小东西自然宝贝得不得了。奶奶三天两头去烧香，完了就去镇上转转，回家时总有东西给她吃的，几颗糖，几块糕，那是别的乡村孩子所享受不到的。

1.2.5 序列同源性分析

目标DNA序列，利用DNAStar和GenDoc2.0软件进行同源性比对分析、系统发育树构建和序列分析。

1.2.6 生物信息分析

目标基因的同源功能比较分析，采用NCBI在线工具(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/)进行蛋白序列同源比对。蛋白质一级序列分析采用在线工具(Expasy)的2个模块(http://www.expasy.org/protparam/)和(http://ca.expasy.org/protscale/)进行基本理化性质和亲疏水性等分析。利用在线工具http://www.ebi.ac.uk/interpro/进行蛋白质功能分析。

2 结果与分析

2.1 目标DNA片段Zm3325-ZaC546的分离

2.1.1 利用Zm3325F/R引物对进行PCR的温度条件

利用Zm3325F/R引物(对)，从玉米自交系ZaC546基因组中分离到的目标DNA序列长度为1 024 bp(包括上下游限制性内切酶序列)。为摸索利用该引物(对)从玉米自交系ZaC546中分离目标DNA片段的最佳PCR温度条件，在正向引物和反向引物Tm的延伸温度范围内进行梯度PCR。结果表明，利用Zm3325F/R引物(对)扩增的目标条带位置在1 000 bp处，与预期结果相符合。

在所设置的温度梯度范围内，在53.4～62 ℃之间PCR效果较好，其中以56 ℃条件下PCR产物量最高、没有杂带。当温度超过59 ℃时，虽然没有出现杂带，但PCR产物量降低。当温度≤53.4 ℃时，虽然同样扩增出目标条带，但有非目标条带出现。说明对于Zm3325F/R引物来讲，PCR反应的最佳温度为56 ℃左右(图1)故在后续实验中，Zm3325F/R引物进行的PCR反应，均采用56 ℃。

M为 DL2 000 DNA Marker

2.1.2 PCR产物(目标DNA片段Zm3325-ZaC546)的回收

在PCR产物琼脂糖凝胶上电泳结束后，在凝胶成像仪上，切取含有目的条带的胶条，然后按DNA回收试剂盒(E.Z.N.A.Gel Exteaction Kit 100，Omega)的操作说明书回收PCR产物(目的条带DNA)。由图2可知，目的DNA片段(所回收的PCR产物)与预期结果一致，而且产物纯净,产物质量符合要求，可用于与T-载体的连接与克隆。

M1和M2分别为DL15 000和DL2 000 DNA Marker；1为PCR产物的回收物。

图2利用Zm3325F/R进行PCR扩增产物回收质量检测图
Fig.2RecoveredproductsofPCRproductsusingaprimerpairofZm3325FandZm3325R

2.1.3 目标DNA片段的连接、转化与酶切验证

经检测符合预期结果的目标DNA片段(PCR扩增产物)，在琼脂糖凝胶上切胶、回收目标条带(目标DNA片段)；所回收的目标DNA片段与克隆载体pMD-19T混合，瞬离之后4 ℃过夜，使目标DNA片段与pMD-19T进行连接，从而获得重组质粒pMD19T-Zm3325(bx12)。然后用pMD19T- Zm3325(bx12)重组质粒去转化感受态大肠杆菌DH5α，并将所转化的大肠杆菌DH5α涂布于含有Amp、IPTG和X-Gal的选择性LB培养基上进行过夜、培养。并观察培养基上所长出的蓝、白斑菌落。

在选择性培养基上长出的菌落中，挑取由重组质粒成功转化的单细胞细菌所繁殖而来的白色单克隆(白色单菌落)，再在液体培养基中进行摇菌培养。然后按质粒提取试剂盒(购自大连宝生物公司)说明书进行操作，从液体培养的转化菌中提取重组质粒。所提取的重组质粒利用BamH I和Xho I进行双酶切，并与以所提取的重组质粒DNA作为模板进行的PCR产物和以玉米自交系ZaC546基因组DNA为模板进行的PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳比较，鉴定这3种来源的目标DNA片段(目的条带)的一致性(图3)。结果表明，利用PCR产物与pMD-19T构建的重组质粒pMD19-Zm3325(bx12)的BamH I / Xho I双酶切产物，在琼脂糖凝胶上分成大小不同2条带。由于pMD-19T质粒大小为2 692 bp，故可确定大片段条带为质粒DNA带。小片段条带与利用ZaC546基因组DNA和重组质粒DNA为模板进行的PCR扩增产物都位于1 000 bp左右的位置上；由于目标DNA长度为1 024 bp(包括BamH I和Xho I位点碱基)，故可确定重组质粒的双酶切产物中，小片段条带为目标DNA片段,说明重组质粒中正确插入了目标DNA片段。

M1和M2分别为DL2 000和DL15 000 marker；

1和2分别为ZaC546基因组和质粒DNA为模板的PCR产物；3为重组质粒的双酶切产物；4为重组质粒。

图3以ZaC546基因组DNA和重组质粒DNA为模
板的PCR产物、重组质粒双酶切产物以及重组质粒的比较
Fig.3PCRproductsamplifiedusingZaC546genomicandrecombinantplasmidDNAastemplates,productoftherecombinantvectordigestedbydoublerestrictionenzymesandtherecombinantvector

2.2 目标DNA序列的测序及其序列分析

2.2.1 目标DNA序列分析

经PCR鉴定和酶切鉴定正确后，对菌液进行扩繁，一部分用于保存菌种，一部分送去测序。测序结果表明，本研究中从玉米基因组中分离的目标DNA序列(Zm3325-ZaC546)(图4)，即上下游限制性酶切点之间的序列(包括引物序列)，长度为1 010 bp；它具有由744个碱基(起始密码子ATG到终止密码子TAA为止)构成的完整的开放阅读框(ORF)。与玉米标准基因组中bx12基因的参考DNA序列GRMZM2G023325相比，在目标DNA片段Zm3325-ZaC546，在其ORF的第1个碱基开始，下游第204个碱基由G突变为A，导致遗传密码由AAG变为AAA，但氨基酸不变，都编码赖氨酸(Lysine，K)，该突变在ORF之内；此外，在第883个碱基G发生缺失，第905个碱基由T突变为C，这2个突变位于ORF的下游(图4)。目标DNA序列Zm3325-ZaC546与参考序列的一致性为99.70%，阅读框序列的一致性为99.87%。

图4 来自ZaC546的目标DNA序列Zm3325-ZaC546与玉米标准基因组参考序列bx12Ref(GRMZM2G023325)的一致性比较Fig.4 Consistency between the target DNA Zm3325-ZaC546 sequence from ZaC546 and reference genome sequence bx12Ref(GRMZM2G023325)

2.2.2 目的基因编码的蛋白质序列分析

本研究中所克隆的目的基因bx12-ZaC546，编码1个由247个氨基酸所组成的蛋白质；与编码邻甲基转移酶的bx12基因的参考DNA序列相比，虽然所克隆的目标DNA序列的ORF内部从起始密码子的第1个碱基算起，下游第204个碱基由G突变为A，导致遗传密码由AAG变为AAA，但氨基酸不变，都编码赖氨酸(Lysine，K)，故目的蛋白质(Zm3325-ZaC546P)的氨基酸序列与参考蛋白质(邻甲基转移酶蛋白)氨基酸序列相比，两者完全相同(图6)。

图5 目的基因所编码的蛋白(Zm3325-ZaC546P)氨基酸序列与标准基因组参考序列的比较Fig.5 The Identity between the amino acid sequences of protein encoded by the target DNA Zm3325 from ZaC546 and reference gene bx12Ref(GRMZM2G023325)

2.3 Zm3325-ZaC546P的理化性质

Zm3325-ZaC546P的分子量为26 458.3，元素总量为3 725(表1)；各组成元素中，H和C元素含量最高，分别为1 864和1 178；其次为O和N元素，分别为343和330；S元素含量最低，仅为10。Zm3325-ZaC546P亲疏水性值为0.111，其负电荷残基总数(23)高于正电荷残基总数(18)；该蛋白质的消光系数为0.736、等电点为6.10、稳定系数为38.85，其半衰期在酵母中大于20 h，在大肠杆菌中大于10 h。不稳定系数用于表示一种蛋白质在介质中稳定性；在ExPASy-ProtParam平台上估算出的不稳定系数(II)值小于40则表示稳定,大于40则表示不稳定。本研究中克隆的基因编码的目的蛋白，即邻甲基转移酶蛋白的不稳定系数(38.85)小于40，说明该蛋白质适于在中性环境中起作用，且活性稳定。

表1 Zm3325-ZaC546P基本理化性质Table 1 Amino acid composition of Zm3325-ZaC546P

注：**表示该蛋白质稳定

2.4 Zm3325-ZaC546P的功能分析

在NCBI上，在线分析表明，来自ZaC546的Zm3325-ZaC546P，属于邻甲基转移酶基因超级家族2(O-methyltransferase super family 2)(图6)。该基因家族的蛋白(邻甲基转移酶)，是多功能酶；该家族酶，具有2个大的结构域，分别代表了2大功能，N-末端一侧的大结构域，具有翼螺旋-转角-螺旋DNA结合功能和植物甲基转移酶二聚化功能；C-末端一侧的大结构域具有依赖于腺苷甲硫氨酸的甲基转移酶功能和邻甲基转移酶功能。从目的蛋白Zm3325-ZaC546P的序列上看，它含有2个大的结构域(图6,7)，N-末端一侧的大结构域具有蛋白质二聚化功能(protein dimerization activity)；C-末端一侧的大结构域具有邻甲基转移酶功能(O-methyltransferase activity)，该结构域还负责甲基转移酶功能(methyltransferase activity)。

图6 Zm3325-ZaC546 P的保守结构域及其功能Fig.6 Conserved domain and function of Zm3325P-ZaC546

大写加粗字母分别表示甲基化酶二聚化功能域和邻甲基转移酶功能域的氨基酸序列。

3 讨论与结论

为深入研究bx12基因的表达与调控机理，本研究从抗螨的我国玉米自交系ZaC546中克隆出了含有目的基因bx12的目标DNA片段Zm3325-ZaC546，其DNA序列长度为1 010 bp，含有完整的开放阅读框(ORF)。与玉米基因组数据库上的参考序列GRMZM2G023325相比，目标DNA序列在其ORF的内部，从起始密码子的第1个碱基开始，下游第204个碱基位置上存在1个碱基突变，由G突变为A，遗传密码由AAG变为AAA，但氨基酸不变，都编码赖氨酸(Lysine，K)。虽然，目标DNA序列在其ORF的下游，第883个碱基G发生缺失，第905个碱基由T突变为C，但因这2个突变位于ORF的下游，并不影响目的基因的编码活性。目标DNA序列Zm3325-ZaC546与参考序列的一致性为99.70%，阅读框序列的一致性为99.87%；而由目的基因编码的蛋白质氨基酸序列与参考序列的一致性为100%。

从蛋白质生物信息学分析结果来看，本研究中克隆的基因bx12-ZaC546编码的邻甲基转移酶蛋白Zm3325-ZaC546P属于邻甲基转移酶基因超级家族2(O-methyltransferase super family 2)。该蛋白具有2个大的结构域，1个位于N-末端1侧，具有甲基转移酶二聚化功能；另1个位于C-末端一侧，具有甲基转移酶功能和邻甲基转移酶功能。总之，本研究中，从玉米自交系ZaC546中克隆出编码邻甲基转移酶蛋白的基因bx12-ZaC546，它编码的蛋白可能是一种多功能的邻甲基转移酶。